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马立克氏病(Marek’s disease,MD)是鸡的一种高度接触性肿瘤病,以淋巴组织的增生和肿瘤的形成为特征。马立克氏病病毒(MDV)包括三个血清型。所有能引起肿瘤的MDV病毒属于血清1型(MDV-1),天然不致瘤的MDV属于血清2型,火鸡疱疹病毒(HVT)属于血清3型。2001年,从中国广西某鸡场中分离得到一株1型MDV GX0101,其特点是:有禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列(LTR)的插入。为了解REV长末端重复序列(LTR)的插入给GX0101带来的影响,在将该毒株构建成细菌人工染色体(BAC)克隆的基础上,将REV-LTR敲除构建成了重组病毒GX0101ΔLTR,通过动物证明,REV-LTR的插入导致了GX0101的水平传播能力的显著增强;在BAC—GX0101的基础上,进一步敲除两个致肿瘤基因Meq,得到的缺失株GX0101Δmeq,后期研究发现,该缺失株在失去对鸡群的致病性和免疫抑制的同时,还能对鸡群起到很好的保护作用,其保护效果要超出现有CVI988疫苗。本研究以GX0101ΔMeq作为载体表达H5N2禽流感病毒的HA基因,成功构建了一株重组病毒。1.抗H5N2-HA鼠多克隆抗体的制备及H5N2-HA真核表达载体的构建为了验证以GX0101ΔMeq为载体构建的表达H5N2-HA的重组病毒中的HA基因在体外能否正常表达,首先需要制备抗H5N2禽流感HA的鼠多克隆抗体。HA基因,先从NCBI上获取H5N2禽流感JX534549株的HA基因全序列,再由生工生物工程(上海)有限公司合成。将其分成两段分别插入到PET-32a原核表达系统,构建了能够分段表达HA蛋白的原核表达质粒,将两个质粒导入到BL21菌株。通过诱导表达发现,只有一段HA蛋白能够大量表达,而另一段没有表达,我们用大量表达的该段的HA蛋白作为抗原免疫小鼠,三免后采集鼠的血清,为了检测该血清能否作为针对HA蛋白的多克隆抗体,我们以此血清作为一抗,通过IFA检测,经禽流感JX534549株的HA基因的感染性克隆转染的CEF细胞中的HA蛋白,IFA结果显示100倍稀释的该鼠的血清能够检测到细胞中HA蛋白的存在。结果可证明:在本研究中,鼠的血清可以作为多克隆抗体检测HA蛋白的存在,并可在后续研究中用于检测重组MDV中HA基因的表达。构建表达H5N2-HA的重组病毒,首先我们需要构建能够在真核系统中表达HA基因的真核表达质粒。将HA—ORF完整的克隆进真核表达载体pc DNA3.1(-)中,并将该重组质粒转染CEF细胞。以制备的HA多克隆抗体作为一抗,通过IFA验证,真核表达质粒中的HA基因能够成功表达。这些证明,本研究中构建的真核表达质粒能够成功表达HA基因,可以用于进一步的研究。2.以GX0101ΔMeq为载体,应用RedE/T重组系统和Flp/FRT重组系统构建一株表达H5N2-HA基因的重组病毒r GX-CMV-HA第一步:在HA基因表达盒前引入Kanr抗性筛选基因,以后电转进大肠杆菌EL250中,在重组系统Red E/T的作用下,这段带有Kanr抗性筛选基因的HA表达盒就作为外源插入片段整合到载体GX0101ΔMeq上;第二步:在L-阿拉伯糖的诱导下,利用重组系统Flp/FRT将Kanr从重组质粒中敲除掉。通过验证,从含有完全敲除了Kanr抗性筛选基因的重组质粒pr GX-CMV-HA的EL250大肠杆菌中提取质粒,转染CEF细胞,通过IFA验证重组病毒中HA基因的表达。结果表明,通过以上两步重组方法,成功获得了重组病毒r GX-CMV-HA,并且IFA验证表明HA基因能在重组病毒中成功表达。