应激是指在受到各种内外界环境因素刺激时,机体所出现全身范围的非特异性反应。长时程高强度的应激对动物的认知功能具有明确的损伤效应。脑源性神经生长因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）是突触结构维持和认知功能发展的重要分子,研究发现应激对其的抑制作用可能是应激导致认知损伤发生过程的重要诱因,但其机制尚未完全明确。同型半胱氨酸（Homocystein,Hcy）是一种机体内存在的小分子氨基酸,前期研究发现应激条件下机体Hcy水平升高。Hcy除了公认的诱导心血管损伤的作用,新近研究发现其还参与认知障碍发生,但具体机制尚不完全清楚。本研究系统观察了应激性认知障碍发生过程中Hcy对海马Bdnf的抑制性作用,并从DNA 6mA甲基化修饰角度出发,深入揭示了Hcy对Bdnf的转录调控机制,从而为阐明应激导致认知障碍发生的分子机制提供了新的理论依据,并为控制应激性认知障碍防治的医学措施及干预靶点提供了重要思路。一、同型半胱氨酸在慢性应激导致小鼠认知障碍过程中的作用研究为了研究应激对小鼠认知功能的影响规律,选用15～25g的雄性C57BL/6小鼠,采用0～8周慢性不可预见性温和应激模型（Chronic unpredictable mild stress,CUMS）进行应激干预,并分别在0、2、4、6、8周末时间节点对CUMS小鼠及其对照组（Ctrl）进行行为学及生化指标检测。采用糖水偏好实验评价动物模型建立,采用Morris水迷宫实验检测空间学习记忆能力,采用旷场实验检测自主探究能力,采用实时荧光PCR（q-PCR）检测海马Bdnf、Psd95、Syp转录水平,采用免疫印迹（WB）检测海马BDNF、PSD95、SYP蛋白表达,采用免疫荧光（IF）检测海马BDNF分布及水平,采用高尔基染色测检测海马神经元树突棘密度,采用酶循环法检测血浆Hcy水平。糖水偏好实验显示CUMS模型建立成功,并且CUMS应激时程超过6周后血浆Hcy水平显著升高,小鼠空间学习记忆能力显著降低,主要分布在海马及CA1、CA3及齿状回区神经元的Bdnf转录及蛋白表达显著降低,同时Psd95、Syp等突触功能基因转录及蛋白表达显著降低,树突棘密度显著降低,并且Hcy与空间学习记忆能力及海马Bdnf水平均呈显著负相关关系。为了研究Hcy在应激条件下的作用,选用15～25g的雄性C57BL/6小鼠,采用8周CUMS进行应激小鼠模型干预,并分别在8周CUMS基础上通过给予复合B族维生素（CUMS+VBco）灌胃以及在正常小鼠基础上通过给予高蛋氨酸饮食（Met diet）分别实现Hcy的下调和上调,并在干预8周结束后使用上述方法对各组行为学及生化指标检测。结果显示上述方法成功调控了Hcy,且在CUMS基础上下调Hcy后海马Bdnf水平显著增加,突触功能基因转录及蛋白水平明显增加,树突棘密度显著升高,CUMS导致的小鼠空间学习记忆能力得到了显著改善。而上调Hcy后海马Bdnf水平降低,突触功能基因及蛋白水平显著降低,树突棘密度显著降低,诱导空间学习记忆能力损伤出现。同时使用浓度为0、50、150、200、250μM Hcy干预HT22细胞,并在干预后72小时使用上述方法检测生化指标。结果显示0～150μM Hcy干预HT22细胞过程中随着Hcy浓度升高,细胞中广泛存在的Bdnf水平降低,突触功能基因及蛋白水平降低。二、同型半胱氨酸在慢性应激条件下对DNA 6mA甲基化修饰的影响为了明确应激条件下小鼠海马基因组DNA 6mA甲基化修饰的改变规律,选用上述动物,采用0～8周CUMS进行应激干预,并分别在0、2、4、6、8周时间节点对CUMS及Ctrl组小鼠进行生化指标检测。采用点杂交实验（Dot blot,DB）、DpnⅠ酶切实验、6m A免疫荧光染色检测海马基因组DNA 6mA甲基化修饰的分布及水平。结果显示DNA 6mA甲基化修饰广泛存在于海马CA1、CA3及齿状回中神经元核中,随着应激时间增加DNA 6mA甲基化修饰程度降低。为了研究应激条件下Hcy是否参与DNA 6mA甲基化修饰,选用8周CUMS干预组、CUMS+VBco组、Met diet组小鼠以及Hcy干预的HT22细胞,采用上述方法检测基因组DNA6m A甲基化修饰。结果显示下调Hcy后海马基因组DNA 6mA甲基化修饰水平显著升高,而上调Hcy后DNA 6mA甲基化修饰水平显著降低。Hcy干预HT22细胞后细胞基因组显著升高。进一步为了研究应激条件下Bdnf启动子DNA 6mA甲基化修饰的改变规律以及Hcy在该过程中的作用,选用上述动物及细胞模型,采用甲基依赖的限制性内切酶法（Methylation dependent restriction endonucleases,MDRE）及6m A-DNA免疫共沉淀技术（6m A-Methylation immunoprecipitation,6m A-Me DIP）检测Bdnf启动子DNA 6mA甲基化修饰水平。结果显示Bdnf启动子中存在潜在发生DNA 6mA甲基化修饰的‘GATC’位点,Hcy水平较高的CUMS组及Met diet组Bdnf启动子ⅣDNA 6mA甲基化修饰显著降低,CUMS+VBco组修饰显著降低且接近Ctrl组水平。为了明确应激条件下Hcy导致DNA 6mA甲基化修饰改变的原因,选用上述动物及细胞模型,采用q-PCR及WB检测海马及细胞中甲基转移酶N6amt1及转甲基酶Alkbh1转录及蛋白水平,同时采用ELISA检测海马中甲基化潜能的改变。结果显示N6amt1在各组中均无明显改变。随应激时间增加至6周后,CUMS组及Met diet组Alkhb1水平显著升高,甲基化潜能显著降低,CUMS+VBco组Alkbh1水平较于CUMS显著降低,甲基化潜能升高,接近Ctrl组水平。0～150μM Hcy干预HT22细胞过程中随着Hcy浓度升高Alkbh1水平降低。另外,本研究还关注了应激条件下海马基因组DNA 5m C甲基化修饰改变,结果显示应激导致海马基因组DNA 5m C甲基化修饰降低,这一改变趋势与DNA 6mA修饰改变相同。三、DNA 6mA调控Bdnf转录的机制研究鉴于当前研究发现CUMS导致认知损伤过程中升高的Hcy导致Bdnf水平降低,同时Alkbh1升高,基因组及Bdnf启动子DNA 6mA甲基化修饰降低。为了进一步研究DNA 6mA甲基化修饰是否影响Bdnf转录及蛋白表达,选用HT22细胞及15～25g雄性C57BL/6小鼠,在转染及在海马中感染干扰Alkbh1的病毒载体后,分别给予150μM Hcy及8周CUMS干预后检测对DNA 6mA修饰的干扰效果。结果显示干扰Alkbh1显著提高了海马及HT22细胞中基因组及Bdnf启动子DNA6m A低甲基化状态,与此同时,海马及HT22细胞中Bdnf转录及蛋白表达水平显著升高,突触功能基因及蛋白表达水平显著升高,CUMS小鼠树突棘密度显著增加,空间学习记忆能力改善。为了揭示DNA 6mA对Bdnf的调控机制,本研究从Bdnf启动子与转录因子结合的角度入手进行研究。首先结合生物信息学方法预测YY1及TFⅡβ可能是Bdnf的重要启动子,并且干扰Yy1及TfⅡβ对海马及HT22细胞中Bdnf水平具有显著的抑制作用。其次使用Ch IP检测通过干扰Alkbh1的方式干预DNA 6mA甲基化修饰后Bdnf启动子与转录因子结合水平的影响。结果显示通过干扰Alkbh1上调DNA6m A修饰后Bdnf启动子与转录因子结合水平显著升高。由于通过干扰Alkbh1调控DNA 6mA甲基化修饰并非仅针对Bdnf基因,进一步根据Bdnf启动子特点构建发生DNA 6mA甲基化修饰的启动子序列,并采用DNA共沉淀（DNA-immunoprecipitation,DNA-IP）、6m A-体外电泳迁移实验（6m Aelectrophoretic mobility shift assay,6m A-EMSA）以及体外转录实验检测了启动子发生DNA 6mA甲基化修饰对其与转录因子结合能力,结合效率及体外转录水平的影响。结果显示启动子DNA 6mA甲基化修饰显著增加其与转录因子的结合能力,结合效率提升,体外转录产物显著增加。综上所述,慢性应激条件下Hcy升高可能通过影响甲基化潜能以及甲基化修饰代谢酶的综合方式,抑制海马Bdnf启动子DNA 6mA甲基化修饰,并进一步导致其与重要转录因子YY1及TFⅡβ结合能力及效率降低,进而抑制Bdnf转录及蛋白表达,最终诱导认知障碍出现。本研究为揭示应激诱导认知损伤发生机制提供了新的表观遗传学证据,为防治应激损伤提供了新的思路。