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目的:宫颈癌(cervical cancer,CC)是女性常见的恶性肿瘤,位居女性生殖器官恶性肿瘤的首位,是全球最主要的癌症之一。目前研究认为人乳头瘤病毒(human papilomavirus, HPV)感染特别是高危型别的持续性感染,是引起子宫颈癌前病变和宫颈癌的基本原因。HPV为乳头多瘤空泡病毒科的A亚群,是一类具有高度宿主特异性和亲和力、无包膜的、小的双链环状DNA病毒,由核心和蛋白衣壳(L1和L2)组成。其基因组中含有8个开放阅读框架和1个上游调节区,其中E2、E6和E7三个开放阅读框架为病毒癌基因。目前已发现120余种HPV亚型,分子流行病学发现超过2/3的宫颈癌标本被检测出HPV16或18阳性。其DNA可以随机整合到宿主基因组并表达E6、E7癌基因并使宿主细胞永生化,E6、E7基因可以分别表达E6、E7蛋白,其蛋白可以分别和抑癌蛋白p53和视网膜母细胞瘤抑制蛋白(Retinoblastoma tumorsuppressor protain,pRB)结合,阻遏其抑癌功能,进而促进癌症的发生发展。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指在某些生理或病理状态下,上皮细胞失去极性,转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程。它在胚胎形成和组织的形态发生过程中是一个基本的生理过程,特别是中胚层、神经脊、鄂等的发育。但近来的研究发现EMT与肿瘤的发生发展、侵袭和转移有着密切的相关性。目前大量的研究关注于EMT与肿瘤侵袭转移的关系。在诱导EMT发生的众多细胞因子和转录因子中,转化生长因子-β(transforming growthfactor-β,TGF-β)被证实是诱导EMT的关键因子。目前已有大量有关TGF-β参与肿瘤EMT的报道,在宫颈癌中是否也存在这种现象,其与HPV在导致宫颈癌发生发展过程中的关系如何,仍有待研究。方法:①体外培养HPV16阳性的鳞癌(SiHa)和HPV18阳性的腺癌(HeLa)细胞系,分别设计针对HPV16E7的MiRNA干扰载体12MR0018C-1、12MR0018C-2、12MR0018C-3和12MR0018C-4(简称16E7-MiR-1、16E7-MiR-2、16E7-MiR-3和16E7-MiR-4)和针对HPV18E7的MiRNA干扰载12MR0018D-1、12MR0018D-2、12MR0018D-3和12MR0018D-4(简称18E7-MiR-1、18E7-MiR-2、18E7-MiR-3和18E7-MiR-4),采用脂质体瞬时转染方法分别转染针对HPV16和HPV18E7基因的质粒,Real-time PCR方法检测转染前后E7基因的表达差异以沉默效率较高的质粒进行后续稳定转染;②将前期课题组使用的针对HPV16E6和HPV18E6的stealth RNA转换成MiRNA,并构建到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体中,构建成分别针对HPV16E6和HPV18E6的质粒12MR0018A和12MR0018B (简称16E6-MiR、18E6-MiR);③构建分别沉默HPV16和HPV18病毒E6、E7基因的稳定转染细胞系;④Real-Time PCR方法分别检测转染前后EMT的标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)和β-连环素(β-catenin)的表达差异;Real-time PCR方法分别检测转染前后TGF-β1、TGF-βRII(TβRII)和Smad4基因水平的变化。结果:1.成功构建并转染重组质粒,在SiHa细胞系中,转染质粒16E6-MiR后HPV16E6基因的表达明显下降,Real-Time PCR结果显示有效抑制率为77%(P=0);转染质粒16E7-MiR-1、16E7-MiR-2、16E7-MiR-3和16E7-MiR-4后,质粒16E7-MiR-2和16E7-MiR-4可以有效抑制HPV16E7基因的表达,Real-Time PCR结果显示有效抑制率分别达到66%(P=0)和51%(P=0.003),而质粒16E7-MiR-1和16E7-MiR-3则无明显抑制效果。2.在HeLa细胞系中,采用脂质体瞬时转染方法分别转染18E6-MiR质粒,Real-Time PCR检测HPV18E6基因的表达明显下降,与未转染Hela组相比下降约87%(P=0);转染质粒18E7-MiR-1、18E7-MiR-2、18E7-MiR-3和D18E7-MiR-4后,18E7-MiR-1和18E7-MiR-4组HPV18E7基因的表达明显下降,分别下降约68%(P=0)和55%(P=0),而18E7-MiR-2和18E7-MiR-3则无明显抑制效果。3.在SiHa组中,以质粒16E6-MiR和沉默效率较高的质粒16E7-MiR-2构建稳定转染细胞系,进行后续试验。Real-Time PCR结果示HPV16E6、E7基因表达被抑制后,EMT的标志物E-cadherin表达明显升高(P<0.05),而N-cadherin和β-catenin则明显下降(P<0.05)。当HPV16E6、E7基因表达明显被抑制后,Real-Time PCR示TGF-β1、TβRII和Smad4基因的表达水平均明显下降(P<0.05)4.在HeLa组中,以质粒18E6-MiR和沉默效率较高的质粒18E7-MiR-1所构建的稳定转染的细胞系进行后续实验。Real-Time PCR结果示HPV18E6和E7基因表达被明显抑制后,EMT的标志物E-cadherin表达明显升高(P<0.05),而N-cadherin和β-catenin则表达下降(P<0.05)。当HPV18E6、E7基因表达明显被抑制后,Real-Time PCR示TGF-β1、TβRII和Smad4基因的表达均下降(P<0.05)。结论:1.在宫颈癌细胞中,HPV病毒的E6、E7基因可促进上皮-间质细胞转化;当E6、E7基因被抑制后则发生间质向上皮细胞的逆转过程,从而为宫颈癌的治疗提供了新的思路和依据。2. HPV16和HPV18的E6、E7基因可通过TGF-β/Smads信号通路促进了宫颈癌细胞的EMT过程,进而提高了肿瘤细胞增殖、浸润和转移的能力。