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猪δ冠状病毒(PDCoV)是近年发现的一种猪肠道冠状病毒,主要引起仔猪腹泻和肠道损伤。PDCoV为有囊膜的单股正链RNA病毒,属于套式病毒目,冠状病毒科,δ冠状病毒属成员。全长基因组约25.4kb,其基因组序列为5UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-NS7a-3UTR,编码15个非结构蛋白(nsp2-nsp16),4个结构蛋白和3个特异性辅助蛋白。研究证实感染脊椎动物的套式病毒目病毒(冠状病毒科和动脉炎病毒科)编码的内切核糖核酸酶(又称为NendoU)较为保守,在病毒的复制和转录中起着关键作用,并且已证实部分冠状病毒的内切核糖核酸酶(nsp15)和动脉炎病毒的同源蛋白nsp11能够拮抗干扰素(IFN)的产生。我们之前的研究发现PDCoV通过抑制RIG-I信号转导拮抗IFN-β的产生,而PDCoV nsp15是否参与拮抗IFN-β的产生尚不清楚。基于此,本课题以PDCoV nsp15作为研究对象,探究其对IFN-β产生的影响以及具体的作用机制。主要研究内容如下: 1.PDCoV nsp15呈剂量依赖性抑制IFN-β的产生 将不同剂量的PDCoV nsp15真核表达质粒与IFN-β荧光素酶报告质粒IFN-β-Luc、内参质粒pTK-Luc分别共转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析和RT-PCR检测,发现PDCoV nsp15显著抑制仙台病毒(SeV)诱导的IFN-β启动子激活以及IFN-βmRNA表达,并且呈剂量依赖性,提示PDCoV nsp15具有拮抗IFN-β产生的特性。 2.PDCoV nsp15主要抑制NF-κB的活化 IRF3和NF-κB是调控IFN-β产生的关键转录因子,为了探究PDCoV nsp15是否影响它们的活化从而拮抗IFN-β的产生,将nsp15的真核表达质粒分别转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析发现nsp15显著抑制SeV诱导的NF-κB活化并呈剂量依赖性,但对SeV诱导的IRF3的活化无显著影响;IRF3和p65的磷酸化及其核转运分别是IRF3和NF-κB激活的标志,Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明nsp15蛋白主要抑制SeV诱导的p65磷酸化和入核,不影响IRF3的磷酸化和入核。表明PDCoV nsp15主要通过抑制NF-κB的活化拮抗IFN-β的产生。 3.PDCoV nsp15的关键酶活位点为His219、His234和Lys269 根据PDCoV和其他冠状病毒nsp15的氨基酸序列同源性比对及结构同源性分析,推测PDCoV的NendoU结构域活性催化氨基酸位点为His219(H219)、His234(H234)和Lys269(K269)。通过定点突变的方法获得3个突变的nsp15基因,并将其和野生型nsp15基因分别克隆至原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-6P-1-nsp15以及相应的突变体质粒(pGEX-6P-1-H219A/H234A/K269A),经IPTG诱导表达、纯化后,利用荧光共振能量转移试验(FRET)分析发现,与nsp15野生型蛋白相比,3个突变体蛋白的NendoU活性显著降低,说明His129、His234和Lys269是PDCoVnsp15的关键酶活位点。 4.PDCoV nsp15抑制IFN-β的产生不依赖其内切核糖核酸酶活性 有报道某些冠状病毒nsp15和动脉炎病毒nsp11拮抗I型IFN的产生依赖其内切核糖核酸酶活性;也有研究表明动脉炎病毒nsp11潜在的细胞毒性会影响IFN的产生。为了探讨PDCoV nsp15对IFN-β产生的抑制作用是否依赖于其内切核糖核酸酶活性及细胞毒性,首先检测了PDCoV nsp15野生型和突变体的细胞毒性,发现野生型对细胞有一定的毒性作用,3种突变体对细胞几乎没有毒性。在此基础上,将表达PDCoV nsp15野生型及突变体(H219A、H234A和K269A)的真核表达质粒分别转染LLC-PK1和HEK-293T细胞,通过双荧光素酶活性分析发现,3个突变体与野生型一样均显著抑制SeV诱导的IFN-β产生,相互之间无显著差异;且主要抑制p65的磷酸化,而对IRF3的磷酸化无显著影响。进一步以突变体H234A为代表,检测了nsp15突变体对内源性IRF3和p65核转运的影响,结果与nsp15野生型一样,突变体H234A抑制了SeV诱导的p65入核,但不影响IRF3的入核。上述结果表明PDCoV nsp15抑制IFN-β的产生和NF-κ3的活化不依赖其内切核糖核酸酶活性,也不是其细胞毒性所致。