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苯是一种可以引发血液系统疾病的环境污染物。由于苯在石油化学工业和制造业中广泛应用,长期接触可致慢性苯中毒,引起造血功能障碍,主要表现为骨髓增生低下,外周全血细胞减少。有研究发现低氧诱导因子α(HIF-1α)参与调控苯致造血毒性。本研究首先利用HIF-1α高表达(HIF-1α~+)小鼠建立小鼠苯中毒模型,研究苯暴露对小鼠造血毒性及氧化应激的影响,探讨HIF-1α在苯暴露小鼠造血细胞氧化损伤中的作用及其对下游基因的影响;同时利用课题组前期CHIP-Seq技术筛选出的苯毒性相关的HIF-1α下游靶基因,通过GO基因功能查找及ChIP-qPCR验证,筛选出与HIF-1α结合的并与氧化损伤相关的响应基因RNA结合基序蛋白45(RBM45)和含有锚蛋白重复序列及SOCS盒结构域蛋白15(ASB15)。进而通过体外构建RBM45和ASB15高表达细胞株,研究其对1,4-苯醌细胞毒性的调控,探讨RBM45和ASB15高表达是否通过抑制氧化应激对1,4-苯醌致细胞毒性发挥保护作用。最终比较职业苯暴露人群和对照人群外周血中RBM45、ASB15的表达差异,探讨其作为苯造血毒性生物标志的可行性。第一章HIF-1α在苯暴露小鼠造血细胞氧化损伤中的作用及其对下游基因的影响选用SPF级C57BL/6和HIF-1α高表达(HIF-1α~+)两种雄性小鼠,分别设玉米油对照组和苯暴露组(0、150 mg/kg·bw),每组8只,以皮下注射方式连续染毒15天,染毒过程中记录小鼠体重。染毒结束后处死小鼠,分离四肢骨以及主要脏器,收集样本,计算脏器系数,分析血常规、LSK细胞比例变化及氧化损伤相关指标。结果表明,与对照组小鼠相比,苯染毒使两种小鼠的胸腺体比、肺体比、脾体比以及外周血白细胞、红细胞、血红蛋白均显著降低。流式检测结果显示苯暴露后两种小鼠骨髓中的造血干细胞(Lin-Sca-1~+C-Kit~+,LSK)比例显著下降,细胞凋亡率明显增加;而HIF-1α~+小鼠较C57BL/6小鼠LSK细胞比例增加、凋亡率降低。氧化损伤检测结果显示苯暴露使小鼠骨髓细胞的丙二醛(MDA)水平、尾长、尾DNA%及Olive尾距明显增加;且HIF-1α~+小鼠较C57BL/6小鼠上述氧化损伤指标均明显降低。同时苯暴露小鼠骨髓细胞RBM45、ASB15蛋白的表达水平降低,与课题组先前报道的HIF-1α蛋白变化趋势一致;且苯暴露后HIF-1α~+小鼠骨髓细胞中RBM45、ASB15蛋白表达高于C57BL/6小鼠。利用ChIP-qPCR在苯组及对照组C57BL/6小鼠骨髓样本中,检验HIF-1α与RBM45、ASB15的结合水平,发现苯组C57BL/6小鼠中HIF-1α蛋白抗体特异性结合RBM45、ASB15的水平分别是对照组C57BL/6小鼠0.045、0.206倍。以上结果表明苯暴露可引起小鼠的造血功能抑制、骨髓细胞氧化损伤、HIF-1α调控的响应基因RBM45、ASB15水平下降;HIF-1α高表达可通过抑制苯诱导氧化应激进而在一定程度上降低苯致造血功能损伤。第二章HIF-1α靶基因RBM45、ASB15在1,4-苯醌致细胞氧化损伤中的作用及其机制设计慢病毒感染人慢性髓系白血病细胞(K562)获得RBM45、ASB15高表达的细胞株(RBM45~+、ASB15~+)及其对照细胞株(NC-RBM45~+、NC-ASB15~+),RT-PCR法和WB法检测细胞转染效率。使用0、10、20μmol/L浓度的1,4-苯醌处理细胞株,通过MTT实验、彗星实验、流式细胞仪检测细胞增殖抑制、DNA损伤、细胞凋亡率及周期分布情况,WB法检测目的蛋白及其通路蛋白的表达。RT-PCR结果显示RBM45~+转染细胞中RBM45 mRNA相对表达量是对照细胞的5倍,ASB15~+转染细胞中ASB15 mRNA相对表达量是对照的7620倍,表明构建RBM45~+、ASB15~+高表达细胞株构建成功。MTT结果显示10、20μmol/L浓度的1,4-苯醌处理各组细胞24 h和48 h,细胞相对增殖率显著下降。凋亡结果显示细胞凋亡率与1,4-苯醌浓度有剂量反应关系;在相同1,4-苯醌处理浓度下,RBM45~+、ASB15~+细胞凋亡率显著低于其阴性对照组细胞。在1,4-苯醌的作用下,细胞周期主要阻滞在G2期,细胞尾长、尾DNA%及Olive尾距显著升高;与同剂量1,4-苯醌处理的NC-RBM45~+、NC-ASB15~+细胞相比,RBM45~+、ASB15~+细胞的尾长、尾DNA%及Olive尾距明显降低。WB结果显示细胞在1,4-苯醌染毒后RBM45及其下游通路蛋白NRF2、KEAP1,ASB15及其下游通路蛋白PI3K、AKT、P-AKT表达均显著下降。综上结果分析发现1,4-苯醌可致细胞增殖抑制,细胞凋亡增加,周期改变及氧化损伤,可抑制NRF2/KEAP1和PI3K/AKT通路;RBM45、ASB15可通过抑制氧化应激发挥抗氧化作用,表现为促进细胞增殖、减少细胞凋亡及DNA损伤。第三章RBM45、ASB15在职业性苯暴露人群中的分布特征以扬州市四家企业的苯作业人群作为暴露组,来自南京市无苯暴露的健康人群作为对照组,按1:1比例进行性别、年龄匹配,每组150例,收集外周血样本。分析血常规检查结果,分离外周血白细胞,提取RNA,实时定量PCR实验分析RBM45、ASB15的表达情况。外周血象指标显示苯暴露人群的白细胞和中性粒细胞计数、红细胞及血小板数量较对照组人群水平降低。RT-PCR结果显示,与对照人群相比,暴露人群外周血白细胞中RBM45、ASB15的mRNA相对表达量分别降低了51%、62%,且具有统计学差异。以上结果提示RBM45、ASB15的表达下降可能与苯造血毒性有一定的相关性,可作为苯中毒新的潜在的候选生物标志。总结综上,本研究发现HIF-1α高表达可通过调节其下游靶基因RBM45和ASB15降低氧化应激,在一定程度上减轻苯致小鼠造血系统损伤;对RBM45、ASB15高表达的K562细胞株研究发现RBM45、ASB15高表达可减少1,4-苯醌对细胞的增殖抑制、促凋亡和DNA损伤作用,可能机制涉及降低氧化损伤水平、分别调控NRF2/KEAP1和PI3K/AKT通路;同时发现苯接触人群外周血白细胞RBM45、ASB15的表达量较对照人群显著降低,表明RBM45、ASB15可能作为苯暴露氧化损伤及造血毒性的潜在早期生物标志。