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研究背景：Graves病(简称GD)是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病,弥漫性甲状腺肿是其特征性表现之一。患者甲状腺肿越明显,病情越难控制,药物治疗的疗程越长。因此探讨甲状腺肿大的机制,研发有效的治疗方法十分必要。在甲状腺肿大的发生发展过程中,生长因子的作用日益受到重视,其中以胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的作用较为突出。我们前期研究结果显示,GD患者血清和甲状腺组织中的IGF-1水平与甲状腺大小呈正相关；IGF-1通过影响PI3K和核因子NF-κB,上调抗凋亡蛋白FLIP和细胞周期蛋白cyclin D1的表达水平；同时该信号通路还参与细胞周期的调节；提示IGF-1是一种重要的致肿大因子,参与甲状腺肿大的发生和发展过程。薯蓣皂苷(dioscin)系从薯蓣科薯蓣属植物穿龙薯蓣、盾叶薯蓣或穿龙薯蓣、黄山药等植物根茎中提取的一类甾体皂苷,其水解产物为薯蓣皂苷元(diosgenin, Dio)。薯蓣皂苷元作为合成多种甾体激素和甾体避孕药比较理想的前体,其应用前景非常广阔。现代药理研究表明,薯蓣皂苷及其衍生物具有免疫调节、降血脂、抗衰老、抗氧化、抗关节炎、保护胃黏膜、祛痰、溶血、脱敏、灭钉螺、抗肿瘤、抗艾滋病、抗血小板聚集、增强心脏收缩力、减慢心率、抗动脉硬化、改善微循环等多种药理活性。近年来免疫相关性疾病的发病率渐高,尤其是Graves病的发病率增高并呈现发病年龄降低的趋势,薯蓣皂苷既有调节免疫作用,又有抗增殖和诱导凋亡作用,其治疗Graves病的可能性值得我们探讨。细胞周期蛋白在增殖性甲状腺疾病中的作用也受到很大关注。细胞周期蛋白D1(cyclin D1)是一种重要的细胞周期蛋白,在细胞增殖中起正性调控作用, cyclinD1与CDK4和CDK6形成复合体,使Rb蛋白磷酸化,促进G1/S期转移。当cyclin D1蛋白高表达时,就有可能导致细胞异常增殖甚至癌变。细胞周期蛋白B1 (cyclinB1)是典型的G2/M期周期蛋白,G2/M期转换的关键调控分子是cyclin B1/p34cdc2复合物,cyclin B1在S期开始合成并在G2期定位于细胞质,与p34cdc2结合形成有丝分裂促进因子(MPF),促进细胞从G2期进入M期,从而完成有丝分裂。但是在甲状腺细胞内,IGF-1是否通过影响cylinD1、cyclin B1的表达及细胞周期的变化从而参与甲状腺肿大发生发展的过程尚不明确。基于上述研究现状,为了更深入的认识IGF-1在GD甲状腺肿大中的作用机制和薯蓣皂苷元对人甲状腺细胞增殖的影响,以便为临床上探索治疗GD提供实验依据,本研究确定研究的目的与方法如下：目的：1.观察不同浓度IGF-1对体外培养的人甲状腺原代细胞增殖的影响。2.观察薯蓣皂苷元对IGF-1诱导的人甲状腺原代细胞增殖的影响3.观察IGF-1和薯蓣皂苷元是否通过调控cyclin D1、cyclin B1蛋白表达水平影响人甲状腺原代细胞的细胞周期,探讨可能的机制。研究方法：1.人甲状腺原代细胞的培养：外科甲状腺手术中取正常甲状腺组织1-3g,剪成lmm3左右的小块；用加有100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的不含钙镁的HankS液反复漂洗,然后500 g离心5分钟；用适量的消化液(0.2%I型胶原酶,0.125%胰酶,溶于D-HankS液)8-10ml,在磁力搅拌器上37℃水浴消化,消化时间一般为40-60分钟；消化后加5ml含血清的培养液终止消化,用200目不锈钢筛网过滤,500 g离心5分钟。DMEM/F12培养基洗涤沉淀2-3次,于加有10% NBS、2 mIU/ml的TSH、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养;过夜后弃上清,PBS冲洗去除未贴壁细胞,用DMEM/F12培养(10% NBS、2mIU/ml的TSH、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素、2mmol/L谷氨酰胺)1到2天后,用含0.2%NBS的DMEM/F12培养基培养(饥饿-同步化)24 h,之后进入实验干预阶段-即用不用浓度的IGF-1在有或无薯蓣皂苷元的情况下培养。2.人甲状腺原代细胞的鉴定：人甲状腺原代细胞提取后在培养皿中进行细胞爬片,用加有10% NBS、2mIU/ml的TSH的DMEM/F12培养基培养2-3天,然后采用免疫荧光方法进行细胞鉴定,采用DAPI染核,抗-TSH受体抗体染胞膜。3.细胞活力的测定：细胞在皿中培养至密度至70-80%时,消化后转至96孔板,用加有10% NBS、2mIU/ml的TSH的DMEM/F12培养基培养2-3天,用含0.2%NBS的DMEM/F12培养基培养(同步化)24 h,之后进入实验干预阶段；然后采用MTT方法检测细胞活力。4.细胞增殖的检测：人甲状腺原代细胞在培养皿中干预结束后,采用EdU方法检测细胞增殖,荧光显微镜下所有的细胞核显示蓝色(Hoechst染色),增殖中的细胞核显示红色(EdU染色)。5.流式细胞仪检测细胞周期：人甲状腺原代细胞在培养皿中干预结束后,消化后用PBS洗后离心,采用流式细胞仪检测细胞周期,6. cyclin D1、cyclin B1蛋白表达水平检测：采用Western blot检测cyclin D1、cyclinB1蛋白表达水平。结果：1、人甲状腺原代细胞的鉴定免疫荧光结果显示,细胞核被DAPI染成蓝色,细胞膜被抗-TSH受体抗体染成绿色,荧光显微镜下人甲状腺细胞呈现单层、不规则形状并聚集成岛状,抗-TSH受体抗体阳性细胞超过95%。2、MTT结果：MTT结果显示100ng/ml IGF-1能显著增加人甲状腺原代细胞的细胞活力,IGF-1对人甲状腺原代细胞的细胞活力的作用呈现没有量效和时效的影响；20μmol/L薯蓣皂苷元开始能明显抑制人甲状腺原代细胞的细胞活力,而且呈现量效和时效的影响；不同浓度的薯蓣皂苷元和100 ng/ml IGF-1作用时,细胞活力明显下降,薯蓣皂苷元的作用仍呈现量效和时效的影响。3、EdU结果：EdU阳性细胞数(即增殖期细胞)在用IGF-1处理后明显增加,而在薯蓣皂苷元处理后EdU阳性细胞数明显减少；同时用IGF-1和薯蓣皂苷元处理后,EdU阳性细胞数明显减少。4、流式细胞仪检测细胞周期：IGF-1促使更多的细胞进入S期,Go/G1期细胞减少；薯蓣皂苷元阻滞细胞在Go/G1期,S期细胞减少；当用25μmol/L薯蓣皂苷元和100ng/ml IGF-1共同作用时,Go/G1期细胞增加而S期细胞减少,G2/M期细胞没有明显变化。5、Western blot检测结果：100 ng/ml IGF-1作用6 h和12 h能增加cyclin D1蛋白表达,作用24 h后cyclin D1蛋白水平开始减少,作用48 h后cyclin D1蛋白水平明显减少；25μmol/L的薯蓣皂苷元作用6 h对cyclin D1蛋白水平无明显影响,作用12 h和48 h后能降低cyclin D1蛋白的水平;当用25μmol/L薯蓣皂苷元和100 ng/mlIGF-1分别作用12 h和48 h时,明显降低cyclin D1蛋白水平；在以上所有的实验中,cyclin B1蛋白水平无明显变化。结论：IGF-1能促进人甲状腺原代细胞的增殖并促使更多细胞进入S期；薯蓣皂苷元能抑制人甲状腺原代细胞的增殖并阻滞细胞在Go/G1期；而当两者共同作用时,其效果更接近于薯蓣皂苷元单独作用时。