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丙型肝炎病毒是导致慢性丙型肝炎,肝硬化、肝纤维化甚至肝细胞癌的主要病原体。根据世界卫生组织1999年统计,全球约有1.7-2.0亿人感染HCV,我国丙型肝炎病毒的感染率为3.2%,属HCV中高度感染区。除人和黑猩猩是丙型肝炎病毒的自然宿主,至今尚未发现其他自然动物对HCV易感。理想的HCV小动物模型缺乏,严重制约了丙型肝炎相关致病机制的研究,也导致了尚无可完全治愈的临床药物和有效预防的疫苗。2005年高效的HCV病毒细胞培养体系的建立,使得一次性得到背景一致、病毒滴度高的HCV病毒成为可能；其中Charles Rice所构建的J6/JFH1病毒株已经被证实对黑猩猩有较高的感染性。但由于黑猩猩购买、饲养成本较高,亟待发现、开发新的丙型肝炎小动物模型。树鼩是主要分布于我国云南地区,体型较小,繁殖较快的低等灵长类动物。已有研究提示,树鼩可被HCV患者的血清感染,但是由于HCV患者血清的来源不明、病毒滴度较低、树鼩个体背景复杂等原因,丙型肝炎病毒对树鼩的感染性未被最终证实。本研究以人工驯化、繁育的树鼩为实验对象,采用二步灌流、胶原酶消化法,分离、获得树晌原代肝细胞(PTH),用含生长因子的特殊培养基,长期培养PTH。分离获得的PTH,经过2-3天的适应期,逐渐进入对数生长期,培养8-10天后,肝实质细胞开始出现衰老凋亡。培养12天后,肝实质细胞逐渐减少,混杂的纤维状细胞迅速生长。培养过程中的原代肝细胞,用MTT法检测细胞活力,绘制细胞生长曲线,并用倒置显微镜观察细胞形态。丙酮酸氧化酶法检测PTH培养上清中ALT变化水平,发现第2天后ALT水平明显下降,随后一直维持在低水平。较低的转氨酶水平等相关肝功代偿性指标,说明胶原酶消化及相关细胞处理过程对细胞造成的损伤较小。采用J6/JFH1-Huh7.5.1细胞病毒培养体系,培养获得了病毒载量为108IU/ml以上、病毒滴度为106ffu/ml以上的病毒,用于感染生长状态良好的PTH。荧光定量PCR检测培养上清中HCV病毒载量最高可达4×105IU/ml。利用逆转录巢式PCR法,可间歇性检测到培养上清中HCV RNA。利用间接免疫荧光法检测PTH内HCV蛋白的表达,可以观察到HCV感染的PTH发出特异性绿色荧光,证实HCV抗原可在感染细胞中表达。PTH产生的二代HCV感染Huh7.5.1细胞,可在培养上清中检测到较低水平的HCV RNA,说明被HCV感染的PTH所产生的HCV病毒具有感染性。PTH所产生的感染性HCV,可以在PTH中进行病毒传代,第二代病毒与第一代病毒载量水平相当。培养上清中HCV RNA经核酸序列测定,发现5’NCR-C区段、E1-E2区段与J6/JFH1嵌合病毒中的J6对应基因区段高度同源,NS5B区段与嵌合病毒J6/JFH1中JFH1对应基因区段同源,但该区段存在细胞适应性突变I2750M。综上所述,本研究以人工驯化、繁育的树鼩为实验对象,利用二步灌流、胶原酶消化法,获得了生长状态良好的树鼩原代肝细胞,可以满足后续感染实验的要求。病毒核酸定量和定性检测,以及蛋白质水平检测均表明,树鼩原代肝细胞可被J6/JFH1病毒感染,并支持HCV病毒的培养传代,病毒增殖过程中存在HCV基因突变。这些实验结果为树鼩做丙型肝炎病毒小型动物模型,提供了实验依据,并且有助于研究HCV感染与复制的机制。