背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是原发性肝癌中最常见的两种类型,随着外科技术及药物发展,原发性肝癌患者预后得到显著提高,然而肿瘤转移和复发显著降低了患者的生存率和生活质量。索拉非尼是一种多激酶抑制剂,能够抑制肿瘤增殖和血管生成,是目前治疗肝癌的有效药物,能够显著延长患者的生存期,但是耐药性的产生严重影响了治疗效果。因此,如何提高肿瘤对索拉非尼的敏感性,是肝癌治疗中的热点问题。内质网应激是肝癌发病的关键通路,并参与调控癌细胞耐药,中脑星形细胞源性神经营养因子(MANF)是内质网应激信号通路的关键调控分子。然而,MANF与原发性肝癌预后及其调控肿瘤细胞对索拉非尼敏感性的分子机制尚不明晰。本研究中我们探索MANF与原发性肝癌预后相关性,并进一步探索MANF影响肝癌细胞系对索拉非尼敏感性的分子机制。第一部分MANF与肝细胞癌预后相关性及其与索拉非尼治疗敏感性的机制研究研究目的:探索MANF与肝细胞癌患者预后相关性,并探索MANF增加肝癌细胞对索拉非尼敏感性的分子机制。研究方法:1.利用Meta分析方法评价GEO数据库的24个相关数据集中肝细胞癌及癌旁肝组织中MANF表达情况,并通过亚组分析、Meta-回归分析、敏感性分析评价异质性程度及异质性来源。2.Western blot法及免疫组化法检测肝细胞癌患者的肝癌及癌旁肝组织的MANF表达水平,统计分析两种组织中MANF表达差异。两组间的比较根据数据特性选择应用Students’t检验或者one-way ANOVA分析;利用Pearson卡方检验或双尾Fisher精确检验比较两组间的分类资料;根据MANF表达水平将肝癌患者进行分组,利用Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验统计分析两组间总生存(overall survival,OS)和无病生存(disease free survival,DFS)。利用Cox 比例风险回归模型分析肝细胞癌病例的独立预后影响因素。3.PCR、Western blot法检测四种不同的肝组织来源细胞系(正常肝细胞L02以及肝癌细胞系HepG2、MHCC97-H)中MANF的mRNA和蛋白表达水平;上调(MANF质粒)或下调(siRNA)肝癌细胞系中MANF,检测细胞增殖等生物学行为差异。4.索拉非尼处理肝癌细胞系(HepG2、Huh-7、MHCC97-H),检测肝癌细胞系中MANF表达水平变化。序贯上调或下调MANF,检测细胞增殖、侵袭以及凋亡等生物学行为变化。5.使用MANF稳定低表达HepG2细胞,构建裸鼠荷瘤模型,分组应用索拉非尼或安慰剂处理小鼠,动态观察记录肿瘤大小,统计分析不同组小鼠肿瘤大小差异。研究结果:1、通过筛选和评价后,最终纳入数据集24个,累计肝癌样本1475例,正常肝组织981例,所有数据集均来自于回顾性研究。本研究使用随机效应模型,I2被用来判断研究中存在的异质性。经检验,本次Meta分析无显著的发表偏倚和异质性。Meta分析发现MANF在肝细胞癌样本中表达高于正常肝脏组织。2.在266例肝癌病例中,肝细胞癌样本中的MANF表达量(141.503 ± 35.179)显著高于癌旁组织中的MANF表达量(137.1161±35.039,P<0.01)。MANF高表达患者的无病生存期(disease free survival,DFS)较MANF低表达患者短(P<0.05),但总体生存期(overall survival,OS)无显著差异(P>0.05),利用Cox比例风险回归模型分析发现血管侵犯(P<0.05)是患者肿瘤复发的独立危险因素。3.正常肝细胞系L02的MANF mRNA水平(0.5895±0.02627)显著低于肝细胞癌细胞系 HepG2(1.581±0.1455;P<0.01)、MHCC97-H(3.380±0.2901;P<0.01)。siRNA下调HepG2细胞中MANF表达,24h、48h和72h后实验组(MANF siRNA)细胞增殖率分别为 1.413±0.0173,1.863±0.0561 和 2.982±0.0708,而对照组(siNC)分别为 1.45±0.0798,1.944±0.0779 和 3.053±0.1275,两组间细胞增值率无统计学差异;MANF质粒转染上调HepG2细胞中MANF表达水平,24h、48h和72h后实验组(MANF质粒转染组)细胞增殖率为1.444±0.0243,1.997±0.0478 和 3.211±0.0351,对照组(Vector)为 1.368±0.0078,1.952±0.1287和3.085±0.1746结果无统计学差异。4.索拉非尼处理正常肝细胞和肝癌细胞系后,细胞内MANF表达水平显著升高,其中不同细胞系MANF表达水平在索拉非尼处理前后mRNA表达水平分别为:L02:1.352±0.0892 vs 1.895±0.1214(P<0.01);HepG2:1.806±0.1372 vs 2.482±0.1383(P<0.01);MHCC97-H:3.27±0.2504 vs 4.223±0.2544(P<0.01)。5.构建稳定敲低MANF表达的HepG2细胞,应用索拉非尼处理细胞,或利用PERK特异性抑制剂GSK2656157进行拯救实验处理HepG2,检测细胞抑制率,结果显示MANF下调组细胞抑制率为0.866±0.0343,而对照组细胞抑制率为0.765±0.0139,两组抑制率具有统计学差异,细胞侵袭(shNC,20±2;shMANF,2±1)和迁移能力(shNC,24.00±3.606;shMANF,3.333±1.528)下降,凋亡比例增加(shNC,5.933±0.2517;shMANF,14.23±0.4041);而与单用索拉非尼相比,PERK特异性抑制剂GSK2656157可以降低细胞抑制率(0.801±0.0241),恢复细胞迁移(50.33±5.033)和侵袭能力(51.33±4.163),减少细胞凋亡比例(8.300±0.5291),结果具有统计学差异。6.稳定敲低MANF的细胞应用索拉非尼处理后,与对照组相比PERK,GRP78,ATF6,XBP1,CHOP,BAX,BCL-2 和 cleaved-caspase-3 表达显著增加,两组差异均有统计学意义(P<0.01)。而相比索拉非尼处理组,联用PERK特异性抑制剂GSK2656157 可以降低索拉非尼引起的 XBP1(P<0.01),CHOP(P<0.01),BAX(P<0.01),BCL-2(P<0.01),和 cleaved-caspase-3(P<0.01)表达。7.将稳定敲低MANF(sh-MANF)的HepG2细胞种植于裸鼠,构建荷瘤模型,MANF下调组的肿瘤体积(0.48±0.1789)明显小于对照组(0.84±0.1140)(P<0.01).将MANF下调组荷瘤小鼠随机分组,序贯利用索拉非尼处理,或利用PERK特异性抑制剂GSK2656157处理,结果显示索拉非尼联合PERK特异性抑制剂GSK2656157的小鼠肿瘤体积(1.5±0.1581)明显大于单用索拉非尼组(0.48±0.1789)(P<0.01)。研究结论:MANF在肝细胞癌中表达显著升高,与肝细胞癌预后呈正相关。MANF通过调节内质网应激增加肝细胞癌对索拉非尼的治疗敏感性。第二部分MANF与肝内胆管细胞癌预后相关性及其与索拉非尼治疗敏感性的机制研究研究目的:探索MANF与肝内胆管细胞癌患者预后相关性,并探索MANF增加肝内胆管细胞癌对索拉非尼敏感性的分子机制。研究方法:1.利用Meta分析方法评价GEO数据库的4个相关数据集中组织样本中肝内胆管癌及癌旁组织的MANF表达情况,通过I2和敏感性分析评价异质性程度及异质性来源,通过Begg法、Egger法和漏斗图法评价纳入的研究之间存在的偏倚。2.免疫组化法检测肝内胆管细胞癌及癌旁组织中MANF的蛋白表达水平。两组间的比较根据数据特性选择应用Students’t检验或者one-way ANOVA分析;利用Pearson卡方检验或双尾Fisher精确检验比较两组间的分类资料;利用Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验比较MANF表达量高低组间的总生存(overall survival,OS)和无病生存(disease free survival,DFS);利用 Cox 比例风险回归模型分析肝内胆管细胞癌病例的独立预后影响因素。3.上调(MANF质粒)或下调(siRNA)HUCCT1和QBC939细胞中的MANF表达,检测细胞增殖等生物学行为差异。检测HUCCT-1和QBC939增殖能力差异;流式细胞技术检测凋亡比例差异。4.构建慢病毒sh-NC和sh-MANF稳定转染的HUCCT1和QBC939细胞系,序贯利用索拉非尼处理,或利用GRP78特异性抑制剂进行拯救实验,分析比较不同组细胞,检测细胞增殖、侵袭以及凋亡等生物学行为变化。Western blot法检测HUCCT1 细胞中 PERK,GRP78,PDI,IRE1 α,XBP1,CHOP,cleaved-caspase-3 and Bax的蛋白表达水平。5.将MANF稳定低表达的HUCCT1细胞系接种至裸鼠,建立裸鼠荷瘤模型,动态观察、记录肿瘤直径。待四周后应用索拉非尼处理裸鼠,动态观察记录各组肿瘤直径,分析不用组裸鼠肿瘤大小差异。研究结果:1、通过筛选和评价后,最终纳入数据集4个,累计肝内胆管细胞癌样本128例,正常肝组织109例,所有数据集均来自于回顾性研究。本研究使用随机效应模型,I2被用来判断研究中存在的异质性。本次Meta分析无显著的发表偏倚和异质性。敏感性分析显示,这些数据集无显著差异。Meta分析发现MANF在肝内胆管细胞癌样本中表达高于正常肝脏组织。2.在246例肝内胆管细胞癌病例中,肝内胆管细胞癌样本中的MANF的蛋白表达量(99.51 ± 29.16)显著高于癌旁组织中的MANF表达量(88.38±18.04)(P<0.01)。MANF 高表达患者的总体生存期(overall survival,OS;P<0.05))和无病生存期(disease free survival,DFS;P<0.05))较 MANF 低表达患者短,利用Cox 比例风险回归模型发现,MANF高表达(P<0.01)、HBV感染(P<0.05)、肿瘤个数(P<0.05)和肿瘤大小(P<0.05)是本研究中肝内胆管细胞癌病例的独立预后影响因素。3.检测发现在siRNA下调细胞中MANF 72小时后,对照组(siNC)和实验组(siMANF)细胞增殖率分别为HUCCT-1(siNC,2.684±0.2441;siMANF,2.115±0.2016;P<0.01),QBC939 细胞(siNC,2.153±0.0791;siMANF,1.949±0.1362;P>0.05)。在质粒上调细胞中MANF表达72小时后,对照组(FLAG-NC)和实验组(FLAG-MANF)细胞增殖率分别为 HUCCT-1(FLAG-NC,2.707±0.1973;FLAG-MANF,2.797±0.1362;P>0.05)和 QBC939(FLAG-NC,2.249±0.1234;FLAG-MANF,2.258±0.1364;P>0.05);流式细胞技术研究检测,上调和下调细胞中MANF的表达,24小时后实验组和对照组的细胞凋亡率分别为,HUCCT-1(siNC,6.533±0.2454;siMANF,6.817±0.4013;P>0.05;FLAG-NC,4.053±0.5632;FLAG-MANF,3.92±0.8671;P>0.05)和 QBC939 细胞(siNC,6.453±0.2011;siMANF,6.487±0.2676;P>0.05;FLAG-NC,7.023±0.1002;FLAG-MANF,7.23±0.1453;P>0.05),凋亡比例无统计学差异。Western blot法检测发现,敲低MANF后HUCCT-1 细胞中 p-mTOR/mTOR(P<0.01)值降低,上调 MANF 后 HUCCT-1 细胞中p-mTOR/mTOR(P>0.05)值未见统计学差异,PERK(P>0.05),GRP78(P>0.05),IRE1 α(P>0.05),CHOP(P>0.05)在上调和下调组中均未见统计学差异。4.在下调HUCCT1细胞中应用索拉非尼处理细胞,或序贯索拉非尼或利用GRP78特异性抑制剂VER155008进行拯救实验处理细胞,结果显示索拉非尼处理后MANF 下调组(HUCCT1,0.311±0.0566;QBC939,0.272±0.0323)相比对照组(HUCCT1,0.122±0.0251;QBC939,0.146±0.0335)细胞抑制率增加(P<0.01),细胞侵袭(HUCCT1,shNC,80±14.14;shMANF,21±1.414;QBC939,shNC,30±7.071;shMANF,5±12.828;P<0.01)和迁移(HUCCT1,shNC,85±7.071;shMANF,34±5.657;QBC939,shNC,52.5±10.61;shMANF,16±5.657;P<0.01)能力下降,凋亡比例增加(HUCCT1,shNC,9.757±2.5627;shMANF,21.283±3.0595 QBC939,shNC,9.26±0.4419;shMANF,14.983±1.8464;P<0.01);而与单用索拉非尼相比,GRP78特异性抑制剂VER155008可以降低细胞抑制率(HUCCT1,0.149±0.0618;QBC939,0.156±0.0212;P<0.01),恢复细胞迁移(HUCCT1,104.5±21.92;QBC939,57.5±3.536;P<0.01)和侵袭能力(HUCCT1,60±7.071;QBC939,20±2.828;P<0.01),减少细胞凋亡比例(HUCCT1,12.393±0.2078;QBC939,10.323±0.3024;P<0.01)。Western blot 法检测显示经索拉非尼处理后,相比对照组,MANF下调组的HUCCT1细胞PERK(P<0.05),GRP78(P<0.05),PDI(P<0.05),ATF6(P<0.05),XBP1(P<0.05),CHOP(P<0.05),和cleaved-caspase-3(P<0.05)表达显著增加。而应用PERK特异性抑制剂GSK2656157可以降低索拉非尼引起的ATF6(P<0.05),XBP1(P<0.05),CHOP(P<0.05),和 cleaved-caspase-3(P<0.05)表达。5.利用慢病毒sh-NC和sh-MANF稳定转染的HUCCT1细胞系建立裸鼠荷瘤模型,种植肿瘤4周后应用索拉非尼处理,治疗两周后下调MANF组的肿瘤体积(0.566±0.059)明显小于对照组(0.845±0.08)(P<0.01)。研究结论:MANF在肝内胆管细胞癌中表达显著升高,与肝内胆管细胞癌预后呈正相关。MANF通过调节内质网应激增加肝内胆管细胞癌对索拉非尼的治疗敏感性。