论文部分内容阅读
目的:黄绿青霉素(citreoviridin,CIT)是由发霉谷物产生出的次级代谢产物,例如玉米、大米等。研究发现黄绿青霉素在大米中生长速度最快,产毒数量最高。很多大米消费水平高的发展中国家由于温度较高、气候潮湿等储物条件有利于真菌的生长和毒素的产生,因此在这些国家黄绿青霉素污染较严重,成为一个不可忽视的重大的公共卫生问题。黄绿青霉素已经被证实与多种疾病有关。肝脏是解毒的重要器官也是很多真菌毒素的靶器官。动物摄入的黄绿青霉素主要集中于中枢神经系统、肝脏、肾脏和心脏。黄绿青霉素肝脏毒性的分子机制尚未完全明确。细胞自噬是近些年来的研究热点,自噬是指细胞内受损的细胞器及大分子物质包裹于双层或多层膜结构,形成自噬小体,而自噬小体与溶酶体融合并对其内容物进行消化的过程。正常水平的自噬是一种通过降解胞内异常组分以维持细胞稳态的机制,然而自噬水平过度上调则引起细胞自噬性死亡。本实验目的在于研究黄绿青霉素是否改变了细胞自噬的过程及自噬在黄绿青霉素肝脏毒性中所发挥的作用,是保护肝脏细胞还是促进肝脏细胞的死亡。本研究可以进一步加深对黄绿青霉素肝脏毒性分子机制的理解。方法:本实验以Hep G2细胞作为研究对象。用MTT(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测不同剂量黄绿青霉素处理后的Hep G2细胞存活率的变化;预先使用不同试剂(自噬抑制剂3-MA、自噬激活剂雷帕霉素、si RNA Atg5、活性氧抑制剂NAC)处理后,用黄绿青霉素处理Hep G2细胞,检测细胞存活率的变化;用相差显微镜观察细胞形态学变化;用透射电子显微镜观察细胞自噬小体的超微结构;用荧光显微镜观察经Cyto-ID®Green染色的自噬小体荧光强弱的变化;用Western blot(蛋白质免疫印迹法)检测黄绿青霉素处理的LC3(细胞内自噬标记物-微管相关蛋白轻链3)和P62蛋白表达量的变化;用LC3-turnover实验鉴别细胞内聚集的自噬小体是由自噬小体增多所致,还是由自噬小体降解障碍所致;用DCFH-DA(2’,7’-二氢二氯荧光素)检测不同剂量黄绿青霉素处理的细胞内ROS的含量变化。结果:经过不同浓度黄绿青霉素(0?M、1.25?M、2.5?M、5?M)染毒24小时后,随着CIT浓度的增加Hep G2细胞存活率明显下降;用自噬抑制剂3-MA(3-Methyladenine)、ROS(Reactive oxygen species,活性氧)抑制剂NAC(N-乙酰半胱氨酸)和si RNA Atg5干预后,细胞存活率与对照组相比明显增高;用自噬诱导剂雷帕霉素预处理4小时,细胞存活率与对照组相比明显下降。用相差显微镜观察细胞形态学变化可进一步证实以上结论。电子显微镜下可明显观察到自噬小体的双层或多层膜结构,且自噬小体数量增加。荧光显微镜下观察到细胞内的自噬小体随着黄绿青霉素剂量升高而逐渐增多。LC3-II蛋白表达随黄绿青霉素浓度增加而增加,P62蛋白表达随黄绿青霉素浓度增加而减少;在LC3-turnover实验中,用自噬小体与溶酶体融合的抑制剂Cq(chloroquine,氯喹)处理后,与对照组相比LC3-II蛋白表达量明显增多,这说明聚集的自噬小体是由自噬小体生成增多所致,而不是由自噬小体降解障碍引起;用活性氧ROS抑制剂NAC预处理1小时后,与对照组相比LC3-II蛋白表达量明显减少。细胞内活性氧水平随黄绿青霉素剂量的升高而升高;用ROS抑制剂NAC预处理Hep G2细胞可有效降低活性氧水平,并可以逆转黄绿青霉素的细胞毒性。结论:黄绿青霉素可在Hep G2细胞内促进自噬小体的形成。在黄绿青霉素的肝脏毒性中,细胞自噬是细胞死亡的主要原因,而黄绿青霉素诱导的自噬性细胞死亡主要依赖于活性氧的调控。