基于核酸扩增的硫酸盐还原菌分子诊断研究

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金属材料在腐蚀过程中受到微生物腐蚀的影响,硫酸盐还原菌(SRB)是一种能促进金属腐蚀的微生物。本文旨在通过以硫酸盐还原菌厌氧培养体系的建立为基础,在成功培养 SRB菌株的前提下,利用两种核酸扩增技术——聚合酶链式反应(PCR)和重组酶聚合酶扩增反应(RPA)建立快速检测SRB菌株的方法。  通过以厌氧操作箱和厌氧培养盒为主的厌氧培养方法,培养了购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的Desulfovibrio fructosivorans(Df,菌株编号3468)和获赠于中国科学院海洋研究所的Desulfovibrio vulgaris(Dv),Desulfovibrio caledoniensis(Dc)及7株采集分离后未鉴定的硫酸盐还原菌。分别以硫酸盐还原菌16s rDNA中的特异性保守片段和SRB特异性基因异化亚硫酸盐还原酶(DSR)、腺苷酰硫酸还原酶(APS)为模板设计了11对引物。通过聚合酶链式反应(PCR)以标准菌株Desulfovibrio caledoniensis(Dc)基因组DNA为模板验证引物的有效性并用多种SRB菌株以及大肠杆菌DH5α基因组DNA为模板验证引物的特异性,找到了2对能够特异性扩增部分SRB基因组DNA的引物。在PCR验证的2对特异性引物的基础上,初步探索了利用重组酶聚合酶扩增反应(RPA)检测SRB的方法,设计了4对RPA引物,经过验证没有获得特异性检测SRB的引物,但发现其中一对引物可用于PCR方法检测SRB,为将来优化RPA反应体系及引物设计提供了重要参考。
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