第一部分组织水平检测AK、SCC中DNA-PKcs、Akt表达水平[目 的]紫外线照射可诱导光线性角化病（AK）的发生,本研究探讨紫外线诱发AK中DNA-PKcs、Akt的表达变化。[方 法]分别收集AK组织（3例）、鳞癌组织（3例）、正常曝光组织（1例）,癌旁组织（2例）。1.通过q-PCR检测DNA-PKcs、Akt的mRNA表达水平,2.分别提取细胞核及细胞浆总蛋白,WB检测DNA-PKcs、Akt的总蛋白表达水平,DNA-PKcs、Akt的磷酸化水平,3.Co-IP检测DNA-PKcs、Akt是否形成复合体。[结 果]1.q-PCR结果:与正常曝光皮肤和癌旁组织相比相比,AK、SCC中的DNA-PKcs和Akt表达水平明显增高;2.WB结果显示:在细胞核、细胞浆中,AK、SCC与正常曝光皮肤和癌旁组织相比DNA-PKcs、Akt总蛋白和磷酸化蛋白无明显差异;3.Co-IP:在正常曝光皮肤和癌旁组织、AK、SCC都检测到DNA-PKcs、Akt形成复合物。[结 论]1.AK、SCC中DNA-PKcs、Akt表达增加;2.DNA-PKcs与Akt相互结合,可能在肿瘤形成中发挥重要作用。第二部分细胞水平研究紫外线对DNA-PKcs、Akt表达及相互结合影响[目 的]前期在组织水平研究发现,DNA-PKcs、Akt在AK、SCC中表达上调,进一步在细胞水平研究紫外线对DNA-PKcs、Akt表达影响的研究。[方 法]实验一:培养原代角质形成细胞、HaCaT细胞、A-431细胞及SCL-1细胞。1.通过q-PCR检测DNA-PKcs、Akt的mRNA表达水平;2.分别提取细胞核及细胞浆总蛋白,WB检测DNA-PKcs、Akt的总蛋白表达水平,DNA-PKcs、Akt的磷酸化水平;3.Co-IP检测DNA-PKcs、Akt是否形成复合体。实验二:培养原代角质形成细胞,分为对照组和紫外线照射组,紫外线照射组采用15mJ/cm2UAB照射,照射后培养2h、4h、24h后,1.CCK8检测细胞活力;2.平板克隆实验检测细胞增殖情况;3.流式Annexin/PI检测细胞凋亡情况;4.核浆分离,提取细胞质、细胞核蛋白,Western Blot检测DNA-PKcs与Akt总蛋白、磷酸化蛋白表达量差异;5.核浆分离,提取细胞质、细胞核蛋白,Co-IP检测DNA-PKcs与Akt复合体;6.荧光三标进行γ-H2AX、DNA-PKcs、pan-AKT在细胞中的共定位,研究DNA-PKcs、Akt是否定位于DNA损伤处,及γ-H2AX焦点的数量。[结 果]实验一结果:1.q-PCR结果:DNA-PKcs、Akt在A-431细胞、SCL-1 细胞高表达;2.WB 结果:p-DNA-PKcs、p-Akt 在 A-431 细胞、SCL-1 细胞高表达;3.CO-IP结果:在正常细胞、A-431细胞、SCL-1细胞,均检测到DNA-PKcs与Akt的复合物。实验二结果:1.CCK8结果:紫外线照射人角质形成细胞后,培养2h细胞活力增加,24h活力下降,并随着时间的延长活力逐渐下降。2.克隆形成实验结果:紫外线照射人角质形成细胞后,培养2h细胞增殖增加,24h增殖减少,并随着时间的延长活力逐渐下降。3.流式细胞术结果:紫外线照射人角质形成细胞后,培养2h细胞早期凋亡、晚期凋亡、总凋亡减少,24h细胞凋亡增加,并随着时间的延长凋亡逐渐增加。紫外线照射人角质形成细胞后。4.WB结果:紫外线照射角质形成细胞后,培养24h细胞核中DNA-PKcs、AKT表达上调,4h细胞核中p-AKT表达上调。5.CO-IP结果:DNA-PKcs与Akt在细胞核和细胞浆相互结合,UV照射后细胞浆中DNA-PKcs与Akt的结合增加。6.免疫荧光结果:紫外线照射角质形成细胞后,培养24hγ-H2AX焦点数增加。[结 论]1.DNA-PKcs、Akt在肿瘤细胞中表达增加;2.紫外线照射促进DNA-PKcs与Akt的表达。第三部分细胞水平研究DNA-PKcs/Akt正反馈调控机制[目 的]前期在组织水平研究发现,DNA-PKcs、Akt在AK、SCC中表达上调,在体外细胞水平也验证了紫外线照射细胞后DNA-PKcs、Akt表达上调,但两者之间的相互关系尚未表明,本研究探讨紫外线诱发AK中DNA-PKcs、Akt是否形成正反馈机制。[方 法]培养原代角质形成细胞,共10个实验分组,①原代角质形成细胞②原代角质形成细胞+15mJ/cm2 UVB照射③原代角质形成细胞+si-NC④原代角质形成细胞+si-NC+15mJ/cm2 UVB照射⑤原代角质形成细胞+si-AKT⑥原代角质形成细胞+si-AKT+15mJ/cm2 UVB照射⑦原代角质形成细胞+si-DNA-PKcs⑧原代角质形成细胞+si-DNA-PKcs+15mJ/cm2 UVB照射⑨原代角质形成细胞+si-DNA-PKcs+si-AKT⑩原代角质形成细胞+si-DNA-PKcs+si-AKT+15 mJ/cm2 UVB照射。转染48h后15mJ/cm2UVB照射,照射后培养2h、4h、24h后,1.CCK8检测细胞活力;2.平板克隆实验检测细胞增殖情况;3.流式Annexin/PI检测细胞凋亡情况;4.核浆分离,提取细胞质、细胞核蛋白,Western Blot检测DNA-PKcs与Akt总蛋白、磷酸化蛋白表达量差异;5.核浆分离,提取细胞质、细胞核蛋白,Co-IP检测DNA-PKcs与Akt复合体;6.荧光三标进行γ-H2AX、DNA-PKcs、pan-AKT在细胞中的共定位,研究DNA-PKcs、Akt是否定位于DNA损伤处,及γ-H2AX焦点的数量。[结 果]1.CCK8结果:UV照射后,与非照射组比较,2h促进细胞活力,24h抑制,抑制DNA-PKcs与Akt,在紫外线照射后,2h细胞活力增加,随着时间的增加,细胞活力开始下降,24h表现为抑制细胞活力;2.UV照射后,与非照射组比较,2h克隆增加,24h克隆减少,抑制DNA-PKcs与Akt,在紫外线照射后,2h细胞克隆增加,随着时间的增加,克隆增殖开始减少,24h表现克隆增殖明显减少。3.流式细胞术结果:UV照射后,与非照射组比较,2h早期凋亡、晚期凋亡、总凋亡减少,24h早期凋亡、晚期凋亡、总凋亡增加,抑制DNA-PKcs与Akt,在紫外线照射后,2h细胞早期凋亡、晚期凋亡、总凋亡减少,随着时间的增加,细胞凋亡开始增加,24h表现为细胞早期凋亡、晚期凋亡、总凋亡增加;4.WB结果:在细胞核与细胞浆中,UV照射后,与非照射组比较,DNA-PKcs、Akt、p-DNA-PKcs、p-Akt 表达上调,抑制 DNA-PKcs 与 Akt,在 UV 照射后,Akt表达上调;5.CO-IP结果:DNA-PKcs和Akt干扰后,DNA-PKcs与Akt的结合降低,UV照射后又增加DNA-PKcs与Akt的结合,其中在胞浆中结合增加显著。6.荧光免疫结果:DNA-PKcs、Akt存在于细胞核和细胞浆,DNA-PKcs主要位于细胞核,Akt主要位于细胞浆。UV照射后刺激后细胞的DNA损伤引起DNA-PKcs从核内向细胞质移位,磷酸化细胞质中的Akt,并引发Akt向细胞核移位。单独干扰DNA-PKcs和Akt时,γ-H2AX焦点数随UV照射时间的延长而增加,同时干扰DNA-PKcs和Akt的表达时,γ-H2AX焦点数随UV照射时间的延长而增加的趋势变缓。[结 论]1.DNA-PKcs、Akt在肿瘤形成中可能发挥重要作用;2.DNA-PKcs、Akt的正反馈调控机制,在紫外线诱发AK中似乎不发挥重要作用。第四部分小鼠水平研究DNA-PKcs/Akt正反馈调控机制[目 的]紫外线照射可诱导光线性角化病（AK）的发生,本研究在动物水平上探讨紫外线诱发AK中DNA-PKcs/Akt的正反馈作用。[方 法]选用5只C57B/6小鼠（18-22g）作为对照组,选择5只基因敲除DNA-PKcs的Prkdc-/-小鼠作为实验组,两组同时给予紫外线照射,紫外线照射采用UVA和UVB混合的亚红斑剂量（90%MED）照射,于第3周增至1 MED,以后每周递增12.5%MED,到第8周照光剂量增至UVB 325mJ/cm2和UVA4875mJ/cm2,以后维持该剂量进行照射至20周处死,一部分皮肤组织分离出表皮组织用于WB检测Akt、DNA-PKcs、Akt Ser473、Akt Thr308、Bax、Bcl-2、p53、p53 serine-15、SP1、c-fos、c-myc蛋白相对表达水平。切取一部分皮肤组织（包括真表皮）进行HE染色、组织病理鉴定;免疫荧光共聚焦技术检测、计数γ-H2AX焦点（共聚焦）,Ki-67（免疫荧光）检测细胞活力、TUNEL染色（荧光染色）检测细胞凋亡情况。[结 果]1.实验组小鼠于12周长出新生物,对照组小鼠于18周长出新生物,实验组更早长出新生物;2.照光20周后,敲除DNA-PKcs的小鼠的背部组织蛋白 WB 结果显示 Akt S473、AktT308、bcl2、bcl2/BAX、c-Fos 表达均降低,结果具有统计学意义（p<0.05）;p53 serine-15表达上调,结果具有统计学意义（p<0.05）;2.与对照组相比,实验组γ-H2AX数减少,细胞活力下降,凋亡增加,结果具有统计学意义（p<0.05）。[结 论]1.在动物水平上验证了 DNA-PKcs对Akt的正调控作用;2.DNA-PKcs可促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,发挥促癌作用。