论文部分内容阅读
目的:研究浅表热应激对铥激光前列腺术后创面修复的影响;以及浅表热应激激活前列腺基质细胞释放外泌体并促进前列腺上皮细胞发生上皮间质转化的机制;并建立比格犬铥激光前列腺切除模型并探究浅表热应激在体内对铥激光前列腺术后创面修复的影响;从而揭示铥激光前列腺术后浅表热应激介导的上皮细胞基质细胞cross-talk在创面修复中发挥的作用。方法:1、通过水浴方式建立细胞浅表热应激模型,并通过CCK-8检测细胞存活率以选取细胞最适宜浅表热应激条件,并通过流式细胞术和蛋白免疫印迹检测细胞浅表热应激模型建立的有效性。2、CCK-8细胞增殖法、划痕实验、流式细胞术、Transwell实验、EDU染色实验以及蛋白免疫印迹检测浅表热应激后非接触同培养基质细胞WPMY-1对BPH-1细胞增殖迁移能力的影响。3、应用蛋白免疫印迹法及免疫荧光双标法对浅表热应激后非接触同培养基质细胞WPMY-1对BPH-1细胞上皮间质转化能力的影响,从而说明浅表热应激后基质细胞分泌的某些成分可以促进上皮细胞发生间质转化从影响创面修复。应用抗体芯片检测浅表热应激后前列腺基质细胞WPMY-1上清液中的成分,分析浅表热应激后基质细胞上清分泌的细胞因子或蛋白成分。将分离的外泌体刺激浅表热应激后的前列腺上皮细胞BPH-1,并采用信号通路PCR-array观察BPH-1细胞增殖相关的信号通路表达变化,蛋白免疫印迹验证相关信号通路关键蛋白表达变化。4、建立比格犬铥激光前列腺切除动物模型,并随机分为对照组、Gefitinib组及GW4869组,应用HE染色、免疫组织化学及免疫荧光标记法观察三组比格犬前列腺尿道部再上皮化程度以及前列腺基地细胞增殖转化及迁移能力,应用免疫荧光标记法及酶联免疫法及免疫荧光标记法观察三组比格犬前列腺部M1及M2型巨噬细胞浸润及分泌细胞因子IL6、IL12、TNF-α及IL-10、TGF-β的差异,蛋白免疫印迹检测M1及M2型巨噬细胞marker以及基质金属蛋白MMP2,MMP9的表达变化,从而探讨浅表热应激诱导外泌体传递EGFR在创面修复中发挥的作用。结果:1、成功建立前列腺基质细胞及上皮细胞浅表热应激模型,并通过CCK-8细胞增殖实验选择两种细胞的浅表热应激条件,该条件下前列腺基质细胞及上皮细胞受损而并未死亡;通过流式细胞术检测浅表热应激后前列腺基质细胞及上皮细胞凋亡率明显增加,细胞发生G2期阻滞,增殖能力下调;周期蛋白cyclin B1及检查点蛋白chk-1表达量增加而分化相关蛋白p21表达上调,热休克蛋白HSP70,HSP90及凋亡相关蛋白PARP表达显著增加。2、将BPH-1水浴浅表热应激后分为三组,非共培养组(对照组),正常WPMY-1共培养组(WPMY-1组)以及浅表热应激WPMY-1共培养组(WPMY-1-HI组),三组中WPMY-1浅表热应激组BPH-1的增殖能力显著提高并且凋亡率显著降低,周期蛋白cyclin B1,检查点蛋白chk-1以及分化相关蛋白p21表达下调;三组中浅表热应激WPMY-1组中BPH-1迁移能力显著提高并发生上皮间质转化,蛋白免疫印迹及q RT-PCR实验显示上皮细胞相关蛋白E-cadherin表达下调而间质细胞相关蛋白N-cadherin,Vimentin,Snail表达显著上调。3、将浅表热应激后的WPMY-1细胞培养上清液收集进行蛋白芯片分析发现,EGFR表达显著提高;对浅表热应激WPMY-1上清液分离外泌体并进行蛋白免疫印迹发现外泌体中EGFR表达显著提高。将浅表热应激后的WPMY-1分离的外泌体刺激BPH-1后利用PCR芯片检测发现与增殖及EMT相关的NF-κB信号通路活化,蛋白免疫印迹对信号通路关键蛋白检测表明NF-κB信号通路蛋白p-NK-k B表达显著增加。应用anti-EGFR中和抗体及GW4869抑制外泌体分泌后浅表热应激WPMY-1共培养组BPH-1的增殖能力、迁移能力、EMT变化不明显。4、建立比格犬铥激光前列腺切除术动物模型,并分为实验组口服EGFR抑制剂Gefitinib,口服GW4869及对照组口服安慰剂。HE染色结果显示:Gefitinib组及GW4869组前列腺尿道部再上皮化速率显著低于对照组,免疫组织化学结果显示:Gefitinib组及GW4869组前列腺尿道部创面EGFR表达水平显著降低,Ki-67表达量显著降低提示EGFR抑制后创面的增殖修复速率减慢。免疫荧光共定位结果显示:Gefitinib组及GW4869组p63/uroplakin-3双阳性的尿路上皮细胞数量显著少于对照组,提示外泌体EGFR对于p63阳性的基底细胞分化增殖迁移有一定影响。ELISA结果显示:Gefitinib组及GW4869组M1型巨噬细胞分泌的炎性因子IL6、IL12、TNF-α数量增加,分泌时相延长;M2型巨噬细胞分泌促进修复的因子IL10、TGF-β数量减少,分泌时相缩短。免疫荧光标记M1型巨噬细胞表面marker分子CD86及M2型巨噬细胞表面marker分子CD206提示,外泌体EGFR可延缓或减少M1型巨噬细胞浸润,促进M2型巨噬细胞浸润。蛋白免疫印迹结果表明实验组M1型巨噬细胞分子CD86、TNF-α表达量增加,而M2型巨噬细胞分子CD163、CD206表达量减少,基质金属蛋白MMP2、MMP9的表达量也减少较为显著,提示EGFR抑制剂Gefitinib可以显著增加M1型巨噬细胞浸润同时减少并延缓M2型巨噬细胞进入创面的时间。结论:1、细胞浅表热应激共培养模型中,浅表热应激后WPMY-1共培养组BPH-1细胞存活能力显著增强并发生EMT对外界刺激可以起到暂时创面保护作用。2、浅表热应激后前列腺基质细胞分泌外泌体中包含EGFR分子并向BPH-1传递激活了BPH-1细胞中增殖迁移相关的信号通路有助于前列腺上皮修复及创面保护。3、EGFR-NF-κB信号通路在前列腺上皮细胞增殖迁移及创面保护上起主要作用。4、比格犬铥激光前列腺切除模型中实验组口服EGFR抑制剂吉菲替尼组的前列腺创面再上皮化速率及程度均有所延缓,基底细胞分化增殖迁移能力也降低;同时Gefitinib组比格犬前列腺巨噬细胞极化也受到影响,M1型巨噬细胞浸润增加并分泌多量的炎症因子抑制创面修复,而M2型巨噬细胞浸润减少并延迟分泌少量的促修复相关分子。综合以上结果,铥激光前列腺切除术所产生的浅表浅表热应激通过促进包含EGFR的外泌体分泌进而加强了上皮间质细胞的cross-talk对于创面保护及修复具有一定的促进作用。