水稻草状矮化病毒（Rice grassy stunt virus,RGSV）是纤细病毒属（Tenuivirus）的一个重要成员,由褐飞虱以持久性、增殖型方式传播。RGSV含有6条RNA,均采用双义编码策略,编码12个蛋白。RGSV曾在东南亚,包括越南、印度尼西亚、菲律宾等地大面积爆发,造成农业大量减产;随后在我国的海南、广东、广西、台湾和福建等地也有陆续发生,给粮食生产造成了严重损失。RGSV侵染水稻后会产生典型症状,如植株严重矮化、分蘖增多、叶片黄化,感病后期出现黄褐色锈斑,与植物缺钾的症状相似,而且感病水稻基本不抽穗或者不结实,一旦感病水稻将颗粒无收。近几年,一些学者在该病毒蛋白的功能、遗传多样性、病害防治等研究中取得了一定的成果,但是病毒大部分基因的功能、病毒致病机制、寄主抗病机制、特别是感病植株典型症状的形成机制等都还不清楚。因此,从分子水平上研究病毒蛋白之间及其与寄主蛋白之间的互作关系,构建互作网络,对于研究病毒基因的功能、致病机制、症状形成等具有非常重要的意义。本研究获得的主要研究结果如下:1.构建了 RGSV编码的10个蛋白的互作网络图通过RT-PCR扩增获得了RGSV 10个基因:p1、p2、p3、pc3、p4、pC4、p5、pC5、p6、pC6,分别构建酵母表达载体,经过不同营养缺陷型培养基筛选,获得了这10个蛋白的自身及两两之间的互作情况。Y2H结果显示总共获得了 13对互作关系,分别为p1、p2、p3、pC5这4个蛋白的自身互作以及两两互作方面的:p1 与 p2、p3、p4、p5 互作;p2 与 p3、p5 互作;p3 与 p4、pC4 互作;p4与p5互作;利用BiFC技术进一步验证了这些蛋白间的互作关系,总共获得了其中的9对互作关系;由此绘制出RGSV蛋白之间的互作网络图。2.筛选鉴定了与RGSV致病因子p3、沉默抑制子p5互作的寄主蛋白。本研究以这两个功能明确且意义重大的蛋白作为诱饵,从本氏烟cDNA文库中钓取与之互作的寄主基因。经过筛库实验,p3蛋白筛选到60个与之互作的本氏烟蛋白,而p5蛋白筛选到7个与之互作的本氏烟蛋白;经过分析寄主蛋白的生物学功能,发现这些寄主蛋白中大部分参与了生物与非生物胁迫过程,这与p3、p5的功能相对应,可能参与了寄主的防御突破及抑制寄主RNA沉默途径。在p3钓取的60个互作的寄主蛋白中,叶绿体相关蛋白占有很大比例,由此推测RGSV叶片黄化症状的形成可能与致病因子p3和寄主叶绿体蛋白的互作有密切的关系。而与p5互作的寄主蛋白中有两个寄主蛋白的功能与囊泡形成、运输相关,由此推测p5在病毒的胞间运动中发挥了重要的功能。从与p3、p5互作的寄主基因中各选取10个和4个基因进行全长互作验证,Y2H结果表明10个水稻蛋白中有8个蛋白的全长还能与p3互作。随后用BiFC进一步验证了 p3与其中的 OsCBLl、OsCIPK5、OsCIPK25 蛋白以及与 p5 与 NbVDAC、NbArfGAP、OsSty-2、NbeEFIA蛋白之间的互作。3.水稻OsCIPK5、OsCIPK25蛋白与RGSV/RSV编码蛋白的互作的广泛性通过研究发现,OsCIPK5、OsCIPK25不仅能与p3互作,还能与p1以及RGSV的沉默抑制子p2、p5互作。同时还发现,OsCIPK5、OsCIPK25还能与同属的RSV的沉默抑制子NS2、NS3互作。OsCIPK5和OsCIPK25与沉默抑制子的互作可能具有重要生物学意义。进一步研究发现,p3除了与OsCBLl互作外,与钾离子吸收途径 OsCBLl-OsCIPK23-OsAKTl 中的 OsCIPK23、OsAKTl 都能互作,根据OsCBLl-OsCIPK23-OsAKTl吸收钾的功能以及表达特性,推测p3与这些基因间的互作影响了植物钾元素的吸收,导致植物出现缺钾症状。4.OsCBLl/OsCIPK5/OsCIPK25参与RGSV缺钾症状形成机制的研究（1）通过功能域分析OsCIPK5、OsCIPK25含有蛋白激酶典型的两个功能结构域,即N端激酶活性结构域和C端调节结构域;（2）蛋白激酶OsCIPK5、OsCIPK25的酶学特性分析:利用原核表达系统诱导表达了 OsCIPK5和OsCIPK25重组蛋白。采用体外磷酸化实验分析了纯化蛋白的酶学特性,结果表OsCIPK5和OsCIPK25蛋白的自磷酸化活性不受Mg2+的激活,而受Mn2+和Ca2+的激活。其中Mn2+和Ca2+对OsCIPK5蛋白的自磷酸活性只有微弱的激活作用,而对OsCIPK25蛋白的自磷酸化活性具有强烈的激活作用;（3）蛋白激酶基因在不同胁迫处理下的表达特性分析:利用Real-time quantitive PCR分析OsCBL 1、OsCIPK5、OsCIPK25、OsCIPK23和OsAKT1基因在非生物胁迫（低钾处理）和生物胁迫（接毒实验）处理下的表达特性,结果表明:OsCIPK5和OsCIPK25受低钾胁迫诱导表达,其中OsCIPK25在根和叶中都不同程度的受到低钾诱导表达,而OsCIPK5只在根部受到低钾诱导表达。由此推断OsCIPK5和OsCIPK25参与了水稻对低钾胁迫的响应,参与了水稻对K离子的吸收;在接种RGSV的情况下,OsCBL1、OsCIPK5、OsCIPK25、OsCIPK23 和 OsAKT1 的表达量都明显上升,表明这些基因受RGSV的诱导表达;（4）感染RGSV水稻的K含量显著下降,由此推断 OsCIPK5、OsCIPK25、OsCBL1、OsCIPK23、和 OsAKT1 与 RGSV多个蛋白互作形成庞大的互作网络影响了水稻钾离子的吸收,参与了 RGSV感病水稻缺钾症状的形成。（5）水稻OsCIPK5和OsCIPK25 RNAi转基因水稻的培育及表型分析:TO代OsCIPK5和OsCIPK25 RNAi转基因水稻植株明显矮化,OsCIPK5的种子结实不饱满,To代种子不发芽;T1代OsCIPK25 RNAi转基因水稻表现为植株矮化,叶片黄化,由此推断水稻OsCIPK5和OsCIPK25对植物的生长发育非常重要,其中OsCIPK25参与调控水稻K+吸收。