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研究背景和目的神经病理性痛是最常见的慢性痛之一,主要由神经损伤或炎症引起,其显著特点为损伤愈合后疼痛症状依然存在,且痛感强烈、顽固,给患者造成了极大的痛苦,目前其确切机制仍不清楚。核蛋白聚ADP-核糖基化(Poly(ADP-ribose)ation,PAR)是聚ADP-核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)激活后,利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)提供的ADP-核糖,催化其与相关核蛋白结合,形成多聚ADP-核糖基化核蛋白,也被认为是表观遗传学的一种形式。研究发现PARP-1激活通过促进炎症相关的基因表达在炎性疾病的发生过程发挥重要作用。最近研究证明PARP-1催化的核蛋白聚ADP-核糖化通过调控基因转录参与脑学习与记忆的长时程突触可塑性。周围神经损伤或炎症诱导的脊髓水平突触传递的可塑性,被认为是病理性痛形成和维持过程中枢敏感化的基础,但迄今PARP-1在神经病理性痛中的作用及机制仍无系统的研究和报道。本实验采用大鼠腰5脊神经结扎(Lumbar 5 Spinal Nerve Ligation,L5 SNL)疼痛模型,结合痛行为学实验和Western blot、RT-PCR和qPCR等分子生物学技术,观察核酶PARP-1在L5 SNL引起神经病理性痛中的作用以及PARP-1激活调控神经病理性痛的机制。其结果将为进一步阐明神经病理性痛的机制提供新的理论上的依据,同时也可能为临床病理性痛的防治提供新的药物作用靶点。研究结果1.大鼠L5 SNL后PARP-1及其催化产物PAR、以及致炎细胞因子IL-1β和TNF-α在DRG和脊髓中的表达变化(1)L5 SNL模型的建立将实验用雄性SD大鼠随机分为实验组(L5 SNL组,n=10)和对照组(sham组,n=8),参照文献报道的方法进行L5 SNL手术,测试术前3、1天和术后1、3、5、7、10、14、21、28天的机械刺激撤足阈值(Paw withdrawal threshold,PWT)和热刺激撤足潜伏期(Paw withdrawal latency,PWL),发现从术后1天开始大鼠术侧后肢PWT和PWL开始显著下降(与sham组相比较,***P<0.001,**P<0.01),并且在术后第7天达到最低(与sham组相比较,***P<0.001,***P<0.001),而对侧无明显变化。(2)L5 SNL后大鼠DRG和脊髓背角PARP-1、PAR及致炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达变化取术后0、1、3、7、10、14天大鼠术侧L4-5 DRG和L4-5脊髓进行RT-PCR和qPCR检测PARP-1 mRNA含量的变化,取对侧L4-5DRG和L4-5脊髓进行qPCR检测PARP-1 mRNA含量的变化,取术侧L4-5 DRG和L4-5脊髓进行Western blot检测PARP-1及其下游产物PAR以及致炎细胞因子IL-1β、TNF-α表达量变化。RT-PCT和qPCR结果显示L5 SNL可以引起术侧L4-5 DRG和L4-5脊髓PARP-1 mRNA含量升高,并在术后第7天或第10天达到最高(与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3),而对侧qPCR结果显示PARP-1 mRNA含量无明显变化。Western blot结果显示,L5 SNL后PARP-1及催化产物PAR以及致炎细胞因子IL-1β、TNF-α的表达量维持在较高水平,并且在第7天表达量最高(与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)。以上结果表明L5 SNL可引起大鼠术侧L4-5DRG和L4-5脊髓中PARP-1及其催化产物PAR、以及致炎细胞因子IL-1β、TNF-α表达上调。2.大鼠L5 SNL后PARP-1在DRG和脊髓背角表达的细胞类型利用免疫荧光组织化学技术对L5 SNL和正常大鼠的L4-5 DRG和脊髓进行染色拍照观察,发现L5 SNL可以引起PARP-1在DRG和脊髓背角表达升高。进一步采用免疫荧光双染色技术对PARP-1在DRG和脊髓中表达的细胞类型进行了观察,结果显示,PARP-1与DRG中的大中型神经元细胞和小型神经元细胞有共定位,与脊髓中的神经元细胞和卫星样胶质细胞有共定位。3.鞘内注射PARP-1抑制剂Tiq-A能够部分抑制L5 SNL引起的神经病理性痛,同时也可以下调PAR以及致炎细胞因子IL-1β、TNF-α的表达。大鼠L5 SNL后立即鞘内注射PARP-1抑制剂Tiq-A(5、25、50μg/10μl),而后每天1次,连续5天,同时观察大鼠的痛行为学变化。结果显示,与溶剂组(i.t.10μL 10%DMSO生理盐水)相比较,鞘内注射Tiq-A组大鼠术侧后肢PWT和PWL呈剂量依赖性升高(1 d,P<0.001;3 d,P<0.001;5 d,P<0.001;7 d,P<0.001;10 d,P<0.001;14 d,P<0.001,n=8)。Western blot结果显示,与L5 SNL+Vehicle组相比,高剂量组(i.t.50μg/10μl)术后第7天大鼠术侧L4-5 DRG和L4-5脊髓中PAR和致炎细胞因子IL-1β、TNF-α的表达量降低(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)。这表明了抑制PARP-1的活性可以部分抑制神经病理性痛的产生,同时也可以抑制L5 SNL引起的大鼠术侧L4-5 DRG和L4-5脊髓中PAR、IL-1β、TNF-α表达上调的情况。4.神经病理性痛形成后,鞘内注射PARP-1抑制剂Tiq-A能够部分逆转神经病理性痛的症状。L5 SNL后第7天开始,对大鼠进行鞘内注射Tiq-A 50μg/10μl每只每天,连续注射4天,观察大鼠术侧后肢PWT和PWL。结果发现从注射药物后开始,大鼠术侧后肢的PWT和PWL开始出现明显升高,并且在停药后一直持续到术后第14天(7 d,P<0.001;10 d,P<0.001;14 d,P<0.001,n=7)。说明在神经病理性痛建立之后,抑制PARP-1的活性可以部分逆转由L5 SNL引起的神经病理性痛。5.鞘内注射PARP-1 siRNA可以部分抑制神经病理性痛的形成。将实验大鼠随机分为sham+转染试剂(Transfection Regant,TR)组、L5 SNL+PARP-1 siRNA组、L5 SNL+Scramble siRNA组、L5 SNL+TR组,每组8只,术后立即注射药物,siRNA组每天每只1 nmol siRNA,转染试剂组每天每只10μl转染试剂,连续注射5天,同时观察大鼠痛行为学变化。结果显示,鞘内注射PARP-1 siRNA组与L5 SNL+TR组相比,大鼠术侧后肢PWT在术后3天开始出现明显升高(***P<0.001)并一直持续到术后第7天(***P<0.001)。而术侧后肢的PWL在术后1天即出现显著升高(**P<0.01),同样一直持续到术后第7天(***P<0.001)。Scramble siRNA组与L5 SNL+TR组相比较,没有统计学差异。Western blot结果显示,鞘内注射PAPR-1 siRNA可以使术侧L4-5 DRG和L4-5脊髓中PARP-1、PAR以及致炎细胞因子IL-1β、TNF-α的表达量降低(与sham+TR组相比较,#P<0.05,##P<0.01,n=3)。6.运动功能检测发现给药并未对实验大鼠的运动功能造成影响。连续给药后的大鼠在完成机械刺激撤足阈值和热刺激撤足潜伏期的测试后,进行运动功能检测。通过放置反射、抓握反射、翻正反射3种测试之后,给药的大鼠均能保持3种反射的运动功能,没有运动功能异常的情况出现。结论:大鼠L5 SNL后DRG和脊髓背角PARP-1的表达上调通过调控IL-1β和TNF-α的表达,参与了神经病理性痛的形成和维持。