间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell; MSC）是一类存在于多种组织中并具有自我复制及多向分化潜能的细胞。最初由Friedenstein等在骨髓中发现，随后在其他组织中陆续发现MSC的存在，如脂肪组织、脐带华顿氏胶、胎盘组织等。MSC不仅具有较强的增殖能力和多向分化能力，还具有免疫抑制作用，可以抑制同种异体组织移植所引起的免疫排斥反应，延长移植物生存时间。这些特性使MSC在治疗免疫系统疾病及组织、器官移植中有重要的应用价值。由于目前关于MSC免疫抑制作用的机制尚不是十分清晰，尤其对T淋巴细胞增殖抑制作用机制存在较大争议，因此不能保证MSC的临床应用效果及临床治疗的安全性。鉴于此，本研究选取了MSC中来源广泛且容易获得的骨髓间充质干细胞（BM-MSC）、脂肪间充质干细胞（AT-MSC）、脐带华顿氏胶间充质干细胞（WJ-MSC）和胎盘间充质干细胞（PL-MSC），比较其生物学特性并挑选出对于修复组织损伤更有优势的MSC；在此基础上，进一步研究该MSC免疫抑制作用的分子机制。以上研究可为MSC更安全有效的进行医学等领域的应用提供基础理论及实验依据。1．人BM-MSC、AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC的分离、培养及鉴定目的：采用一种简单有效地分离培养BM-MSC、AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC的方法，并观察其形态，检测细胞表面抗原的表达及其成脂、成骨的能力，为后续的实验提供充足的干细胞材料。方法：采用酶消化法分离提纯AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC，采用全骨髓组织贴壁法分离提纯BM-MSC；通过倒置显微镜对细胞形态进行观察；运用流式细胞仪检测两种分离方法得到的四种细胞表面抗原的表达；对四种MSC的多向分化潜能进行检测，包括成脂和成骨能力。结果：消化法可以成功分离出AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC，全骨髓组织贴壁法也可以分离获得BM-MSC，四种MSC均呈纤维细胞样贴壁生长；对细胞表面抗原进行检测，发现四种细胞的表达情况类似，均能阳性表达CD44、CD73、CD90和CD105等MSC的表面抗原，而不表达CD14、CD34和CD45等血液和内皮系统的表面抗原；通过对四种MSC多向分化能力的检测，发现四种细胞均具有成脂和成骨的能力；以上结果均符合国际细胞治疗学会对MSC的定义和标准，说明从上述组织中分离出的细胞均符合MSC的特性。结论：成功分离出BM-MSC、AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC，且细胞符合MSC的标准，包括细胞形态、细胞表面抗原的表达情况和多向分化的能力，适用于后续实验。2．四种MSC的分化及增殖能力对比目的：比较四种MSC的增殖能力、成脂及成骨的分化能力。方法：采用活细胞计数方法检测四种MSC增殖能力；运用流式细胞技术检测四种细胞的细胞周期；采用成脂和成骨诱导分化试剂盒诱导分化MSC；采用成脂细胞计数方法检测四种MSC成脂分化能力，利用骨结节分析的方法检测四种MSC成骨分化能力。结果：WJ-MSC的增殖能力最强（P<0.001），其次为：AT-MSC、PL-MSC和BM-MSC；AT-MSC的成脂能力最强（P<0.001），其次为：WJ-MSC、BM-MSC和PL-MSC；WJ-MSC的成骨能力最强（P<0.001），其次为：PL-MSC、AT-MSC和BM-MSC。结论：WJ-MSC具有较强的增殖能力和成骨分化能力，AT-MSC具有较强的成脂能力。3．MSC对T淋巴细胞的抑制作用及其分子机制研究3.1四种MSC对T淋巴细胞的抑制作用目的：比较四种MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用。方法：采用共培养（MSC与T淋巴细胞共培养比例为1:1、1:5、1:10、1:20、1:50）和Brdu方法检测不同数量MSC对植物血凝素（PHA）激活的T淋巴细胞增殖能力的抑制作用。结果：四种MSC均明显抑制T淋巴细胞增殖，且呈细胞数量依赖性，WJ-MSC、AT-MSC和PL-MSC抑制能力均强于BM-MSC（P<0.05），且WJ-MSC的抑制作用最强。结论：四种MSC对T淋巴细胞的增殖能力有抑制作用，且WJ-MSC对T淋巴细胞增殖能力的抑制作用较强。3.2共培养体系中WJ-MSC的吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达及活性目的：检测与T淋巴细胞共培养后WJ-MSC的IDO表达水平及其活性，观察IDO与T淋巴细胞增殖能力之间的关系。方法：通过RT-PCR及Western blot方法检测与T淋巴细胞共培养后WJ-MSC的IDO基因表达；高效液相色谱串联质谱联用仪（HPLC-MS/MS）检测共培养体系中IDO的活性及1-甲基色氨酸（1-MT）对IDO的中和作用；用ELISA试剂盒检测共培养上清液中IFN-γ的含量。结果：ELISA结果显示单独培养的WJ-MSC不分泌IFN-γ，而激活后的T淋巴细胞分泌大量的IFN-γ并刺激共培养中的WJ-MSC表达IDO；WJ-MSC反过来抑制T淋巴细胞分泌IFN-γ；RT-PCR、Western blot及HPLC-MS/MS结果显示共培养后的WJ-MSC表达有活性的IDO，且其活性明显高于对照组（P<0.001）；共培养体系中加入IDO的活性抑制剂1-MT后，T淋巴细胞的增殖能力恢复81%以上。结论：被激活的T淋巴细胞分泌IFN-γ，且通过IFN-γ诱导WJ-MSC表达有活性的IDO；有活性的IDO抑制T淋巴细胞增殖，推断IDO是MSC发挥免疫抑制作用的机制之一。3.3WJ-MSC阻滞T淋巴细胞周期进程目的：探讨WJ-MSC对T淋巴细胞抑制作用的分子机制。方法：共培养体系中分别加入或不加入IDO抑制剂1-MT，采用细胞周期检测试剂盒检测T淋巴细胞的细胞周期；qRT-PCR检测相关基因mRNA水平。结果：WJ-MSC阻滞T淋巴细胞的G1→S期进程，处于G0/G1期细胞数量增多，其SPF值、PI值小于对照组（P<0.001）；与对照组相比，共培养组T淋巴细胞的增殖相关基因CDK4的mRNA水平下调（P<0.001）；加入1-MT后T淋巴细胞的S期细胞数几乎恢复到对照组水平，同时增殖相关基因CDK4的mRNA几乎恢复到对照组水平。结论：WJ-MSC对T淋巴细胞增殖的抑制是通过表达有活性的IDO下调T淋巴细胞CDK4的基因水平并阻滞其细胞周期G1→S期进程来实现的。3.4WJ-MSC促进T淋巴细胞凋亡目的：分析WJ-MSC对T淋巴细胞凋亡的影响及相关基因的表达情况。方法：共培养体系中分别加入或不加入IDO抑制剂1-MT，采用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡；qRT-PCR检测相关基因mRNA水平。结果：与对照组相比，WJ-MSC能够促进T淋巴细胞凋亡（P<0.001），凋亡率为（22.8±1.6）%；与对照组相比，共培养组T淋巴细胞的抑制凋亡基因Bcl2下调而促凋亡相关基因Caspase3上调（P<0.001）；加入1-MT后T淋巴细胞的凋亡率几乎恢复到对照组水平，同时凋亡相关基因的mRNA几乎恢复到对照组水平。结论：WJ-MSC通过表达有活性的IDO促进T淋巴细胞凋亡，并且是通过Bcl2/caspase途径诱导T淋巴细胞凋亡。4．与WJ-MSC共培养的T淋巴细胞内参基因的筛选目的：评价与WJ-MSC共培养的T淋巴细胞内参基因的稳定性。方法：选择18S、GAPDH、ACTB、PPIA、B2M、RPL13A、HPRT1和TBP8种内参基因，采用geNorm、NormFinder和BestKeeper这3个软件全面评价与MSC共培养后的T淋巴细胞的内参稳定性。结果：B2M是理想的稳定内参基因，而常用的内参基因如ACTB和GAPDH，在T淋巴细胞实验中并不是理想的稳定内参基因。结论：在与WJ-MSC共培养的T淋巴细胞相关实验中，B2M是较理想的稳定内参基因。