背景:头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率极高。这些肿瘤大多处于表浅或重要的解剖位置,而传统的治疗方式存在各自的局限性,所以目前亟需一种有效、微创、全身低毒的治疗方式。水凝胶以其优越的性能如微创、靶向、控释、易降解等受到了广泛关注。然而,将化疗药物和光敏剂共装载至水凝胶中的报道却很少。在本研究中,我们合成了一种纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应性水凝胶(简称NDIMH),将化疗和光疗结合,以期为HNSCC提供一种新的治疗策略。第一部分:纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应水凝胶的合成及表征首先合成基质金属蛋白酶响应水凝胶(简称MH),应用扫描电镜观察其形态、MTT法检测了细胞毒性及观察体内外降解情况;进一步应用溶剂-反溶剂法制备纳米阿霉素及纳米吲哚菁绿,并对纳米药物的稳定性、粒径分布、表面形态等进行表征;最后将纳米阿霉素及纳米吲哚菁绿装载至基质金属蛋白酶响应水凝胶内,合成纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应性水凝胶(简称纳米双载药智能水凝胶),再次应用扫描电镜和体外药物释放试验对其进行表征,明确理化性质。同时制备了纳米阿霉素基质金属蛋白酶响应性水凝胶(简称NDMH)和纳米吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应性水凝胶(简称NIMH),以便后续研究。结果显示,MH在扫描电镜下疏松多孔,利于药物的装载,对细胞增殖无毒副作用,并具有良好的基质金属蛋白酶(MMPs)响应特性;制备的纳米药物稳定性良好,用透射电镜观察纳米颗粒表面光滑圆整、分布均匀。纳米阿霉素平均粒径为81 nm左右,纳米吲哚菁绿为109nm左右;纳米双载药智能水凝胶纳米药物在智能水凝胶中均匀分布,体内外药物释放实验显示,纳米双载药智能水凝胶在MMPs条件下能缓慢释放纳米药物,具有良好的MMPs响应特性。第二部分:纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应水凝胶的光敏特性研究通过体内外光热实验、细胞内活性氧检测和体外细胞摄取实验评估纳米双载药智能水凝胶潜在的光疗特性。首先,利用红外热像仪监测激光照射下磷酸盐缓冲液、游离吲哚菁绿溶液、游离纳米吲哚菁绿溶液、纳米吲哚菁绿智能水凝胶和纳米双载药智能水凝胶体内外的温度变化,以评价其体外光热特性;然后检测了纳米吲哚菁绿智能水凝胶、纳米吲哚菁绿智能水凝胶+激光、纳米双载药智能水凝胶+激光各组活性氧的产生情况;最后通过细胞摄取实验检测了纳米阿霉素智能水凝胶组和纳米双载药智能水凝胶+激光组(808 nm,0.5 W/cm2,8 minutes)阿霉素的摄取情况。体内外光热实验结果显示,在激光(808nm,1.0 W/cm2)照射下,纳米吲哚菁绿智能水凝胶和纳米双载药智能水凝胶升温最高,体内分别增加到了 63.2℃和65.6℃,体外为54.9℃和54.0℃,表明纳米双载药智能水凝胶具有良好的光热效能;活性氧实验结果显示,纳米吲哚菁绿智能水凝胶在808nm激光照射(0.5 W/cm2,8 minutes)后有较强的荧光,而纳米吲哚菁绿智能水凝胶组的荧光强度很弱或不存在,说明近红外照射是光敏剂产生单线态氧的先决条件。纳米吲哚菁绿智能水凝胶+激光组和纳米双载药智能水凝胶+激光组,荧光强度无差异,说明阿霉素并不能促进活性氧的产生;细胞摄取实验结果显示,纳米双载药智能水凝胶+激光组荧光信号要强于纳米阿霉素智能水凝胶组,说明激光照射可以促进细胞对阿霉素的吸收。第三部分:纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应水凝胶的体内外药效学研究以SCC-15为细胞模型,考察了纳米双载药智能水凝胶+激光(808 nm,0.5 W/cm2,8 minutes)的对细胞增殖、侵袭、转移的影响及MMP-2敏感性。MTT实验结果显示,纳米阿霉素智能水凝胶组、纳米吲哚菁绿智能水凝胶+激光组及纳米双载药智能水凝胶+激光组对SCC-15的增殖侵袭均有不同程度的抑制作用,但纳米双载药智能水凝胶+激光组抑瘤效果最强,尤其是在MMP-2存在的前体下;Transwel实验及划痕实验结果提示,纳米双载药智能水凝胶在光照条件下,可抑制SCC-15的侵袭和转移。以SCC-15荷瘤裸鼠为动物模型,待瘤体长至150-200mm3时,瘤内注射给药,对比生理盐水组、纳米阿霉素智能水凝胶组、纳米吲哚菁绿智能水凝胶+激光组、纳米双载药智能水凝胶+激光组裸鼠相对瘤体体积变化、考察各制剂的体内药效学性质。同时将各组肿瘤组织进行免疫组化,检测Ki67的表达和细胞凋亡情况,进一步评估各制剂的抗肿瘤效果。结果显示,体内药效学实验显示,与单一治疗组纳米阿霉素智能水凝胶、纳米吲哚菁绿智能水凝胶+激光相比,联合治疗组纳米双载药智能水凝胶+激光抑瘤效果最为明显。免疫组化结果显示,纳米双载药智能水凝胶+激光组Ki67表达量最少,细胞凋亡数最多,进一步证实了联合治疗比单一治疗抗肿瘤效果更强。综上说明在808nm激光照射下,纳米双载药智能水凝胶可以实现光化协同治疗,优化治疗效果。第四部分:纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋蛋白酶响应水凝胶的体内安全性评价及代谢分布研究以SCC-15荷瘤裸鼠为动物模型,给予药物干预,分组同上。在整个实验期间,定期测量各组小鼠的体重变化。治疗结束后收集裸鼠的主要器官脑、心、肝、脾、肺、肾进行H&E染色。数据显示,治疗期间小鼠体重无明显变化,主要器官H&E染色结果未见异常。这些结果表明,所有的制剂均具有良好的生物安全性,局部控释给药可以实现靶向递送,大大降低药物的毒副作用。利用小动物活体荧光成像系统检测瘤内注射游离阿霉素+吲哚菁绿水溶液或纳米双载药智能水凝胶后,在特定时间点阿霉素和吲哚菁绿的荧光信号。168小时处死小鼠,采集小鼠的肿瘤及主要脏器进行体外荧光成像分析。结果显示,刚开始时阿霉素和吲哚菁绿主要聚集在肿瘤部位,游离组和凝胶组的荧光信号面积在24小时内逐渐变大。24小时后,游离组的荧光信号迅速下降,168小时几乎消失。与之相反的是,纳米双载药智能水凝胶组的荧光信号强度并没有明显下降,注射168小时后肿瘤部位依然可以检测到荧光信号;体外荧光成像结果显示,凝胶组的阿霉素和吲哚菁绿均分布在肿瘤部位和重要脏器中,其荧光信号强度远高于游离组。以上结果表明纳米双载药智能水凝胶具有良好的药物缓释性能,大大延长了阿霉素和吲哚菁绿在瘤内的滞留时间。在本研究中,我们结合靶向技术、纳米技术、光化联合治疗及荧光成像技术,成功地设计了一种新型的药物传递系统,即NDIMH,能够在肿瘤微环境中持续释放纳米阿霉素和纳米吲哚菁绿。通过物理化学表征、光敏实验及体内外药效学研究证实了抗肿瘤效果。据我们所知,这是首次将纳米阿霉素和纳米吲哚菁绿加载到对MMPs敏感的水凝胶中,用于治疗鳞癌(专利申请号:201810815535.2)。综上所述,我们开发了一种新型的药物传递系统,并证明瘤内注射纳米双载药智能水凝胶加以808nm近红外照射,或可作为治疗HNSCC的一种新策略。