论文部分内容阅读
Bt抗虫转基因植物己经在生产上广泛应用。杀虫基因在植物体内定时、定量和定点表达来增强抗虫效果,这是第二、三代植物抗虫基因工程研究及生物安全所关注的重要内容。启动子在基因表达调控中起关键性作用,它在很大程度上决定目的基因表达的时间、空间和强度。目前,植物基因工程广泛应用的启动子是组成型启动子,它们驱动外源基因在植物各种组织和所有发育阶段表达,这无疑增加了植物的代谢负担,并造成物质和能量的浪费,往往还会引起植物形态发生改变,甚至影响植物生长发育。因此,本研究对本实验室分离到的棉花ADP-ribosylation factor 1（arf1）基因启动子的功能进行鉴定,尝试在棉花抗虫基因工程研究中应用。 本研究所构建的植物表达载体pGBI121.A1Bt（A）携带棉花arf1启动子驱动cry1A基因的表达盒;植物表达载体pGBI35SBtA1Bt（B）含有两个cry1A基因的表达盒,分别由CaMV35S启动子和棉花arf1启动子驱动。对照载体pGBI121.4AB（CK）携带CaMV35S启动子驱动cry1A基因的表达盒。 将A、B及CK三个植物表达载体利用根癌农杆菌介导法分别导入烟草,经过卡那霉素筛选,最终得到再生植株231株。转对照载体的烟草再生植株为68株,载体A的烟草再生植株为61株,载体B的烟草再生植株为102株。利用ELISA方法对阳性植株不同部位进行Bt杀虫晶体蛋白表达量测定。在烟草的蒴果中,A系的表达量是CK系的1.5倍,B系的表达量是CK系的2.4倍:在烟草的蒴果壳中,A系的表达量是CK系的1.5倍,B系的表达量是CK系的1.9倍;在烟草的花瓣中,A系的表达量是CK系的1.4倍,B系的表达量是CK系的1.5倍;在烟草的叶中,A系的表达量是CK系的0.3倍,B系的表达量是CK系的1.4倍。结果表明arf1启动子驱动外源杀虫基因在烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣中的表达比对照CaMV35S有显著提高,而在叶中较低。并且发现这两个启动子在功能上可叠加。 进一步将上述三种植物表达载体用花粉管通道法导入陆地棉品种Y18和P13中,共获得T0代种子的重量分别为456.89g和2468.58g。在Y18中通过卡那霉素进行筛选和PCR鉴定,得到转对照载体的CK系转基因植株10株,A系4株,B系3株;在P13中获得A系转基因植株19株,B系8株。并用ELISA方法对阳性植株幼蕾及叶中杀虫蛋白的表达进行了初步检测,结果表明,不同植物表达载体的杀虫基因在棉花中的表达情况比较复杂,与烟草中的情况不完全一致,但数据清晰表明由arf1启动子驱动杀虫基因表达的A转基因株系的幼蕾中,杀虫蛋白的表达量显著高于对照。 本研究分析了arf1启动子在烟草及棉花中表达的特异性,验证了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性,为arf1启动子应用于转基因抗虫棉研究,在棉花蕾铃中优势表达杀虫蛋白,针对性提高转基因棉花中蕾铃抗虫性的新一代抗虫棉研究奠定了基础。