论文部分内容阅读
目的：1、分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs），并鉴定其相关生物学特性。2、通过注射盐酸阿霉素建立大鼠阿霉素肾病模型。3、通过电镜观察，检测生化，应用RT-PCR、Real time PCR、Western blot和ELASA技术观察BMSCs移植和强的松治疗保护大鼠阿霉素肾病的效果，并对骨髓间充质干细胞在阿霉素肾病大鼠中保护作用及机制进行探讨。方法：1、大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的提取、培养与鉴定：通过大鼠淋巴细胞分离液分离出单个核细胞层，密度梯度离心法结合贴壁筛选方法分离培养，不断传代、扩增，并通过流式细胞仪表面标志鉴定与成骨和成脂诱导这两种方法结合起来鉴定骨髓间充质干细胞的生物学特性。2、大鼠阿霉素肾病模型建立：通过非麻醉状态下尾静脉一次性按7.5mg/Kg体重注射盐酸阿霉素，注射盐酸阿霉素14d后，综合各项结果：一般表现，24h尿蛋白定量、肌酐等各项生化指标的检测，同时结合肾脏组织HE染色及电镜形态学观察是否符合大鼠阿霉素肾病模型的要求。3、BMSCs对阿霉素肾病大鼠的保护作用及机制的研究：①实验分组：模型组；强的松组；MSC组；正常对照组。②采用电镜观察干预后4w各实验组肾脏足细胞结构；采用常规生化检测方法动态观察各实验组大鼠24h尿蛋白定量、肌酐等各项生化指标。③应用ELASA检测单核细胞趋化因子-1（Monocyte chemotacticprotein-1，MCP-1）在不同时间点各实验组大鼠血清中表达改变情况。④应用RT-PCR、Real time PCR和western blot技术动态观察足细胞裂孔膜蛋白及骨架相关蛋白nephrin、podocin、synaptopodin，p21，MCP-1在各实验组不同时间点mRNA水平和蛋白水平表达改变情况。结果：1、通过密度梯度离心法结合贴壁筛选方法分离培养大鼠BMSCs细胞易分离，培养，细胞具有间质细胞的表面抗原特征，不具有造血干细胞的表面抗原特征，纯度高，活性高及多向分化潜能，完全符合大鼠BMSCs的生物学特性。2、注射盐酸阿霉素14d后，综合各项结果判定本方法大鼠阿霉素肾病模型建立成功，符合实验要求。3、①干预后4w，MSC组、强的松组与模型组相比，肾脏组织中足细胞足突融合及微绒毛变性明显减少，MSC对阿霉素所造成的足细胞结构的破坏起到一定的保护作用。②MSC输注后，MSC组中24h尿蛋白定量、肌酐、尿素氮、胆固醇、甘油三酯和白蛋白与模型组相比得到很大程度的改善，大鼠的肾脏功能得到了保护，尤其是24h尿蛋白定量减少明显。③干预后2w,MSC组和强的松组中血清中MCP-1表达相对于模型组明显下降，干预后4w和8w，MSC控制炎症能力有所下降，但相对于模型组血清中MCP-1表达仍然是降低的。④干预后4w，MSC组、强的松组与模型组相比，肾皮质中synaptopodin和p21mRNA表达明显上调。⑤干预后4w，Western blot表明MSC组、强的松组与模型组比较synaptopodin和p21蛋白的表达得到上调。结论：1、通过密度梯度离心法结合贴壁筛选方法能够成功从大鼠骨髓中分离出高纯度、高活性的大鼠骨髓间充质干细胞。2、经尾静脉一次性按7.5mg/Kg体重注射盐酸阿霉素能够成功建立大鼠阿霉素肾病模型。3、根据本实验结果表明MSC保护阿霉素肾病大鼠的机制之一是：MSC的输注抑制了肾组织内MCP-1的产生，减轻了肾组织的炎症损伤，通过增强p21的表达抑制细胞的增殖,通过维持足细胞骨架相关蛋白分子synaptopodin结构的完整，改善了蛋白尿，保护阿霉素导致的肾小球的损害，达到延缓疾病进展的作用。