前言缺血性脑损伤是临床上常见的脑血管疾病,其发病率、死亡率均很高。其中血脑屏障(blood brain barrier, BBB)损伤是缺血性脑损伤的重要表现,而且血脑屏障损伤又将进一步加重脑损伤,因而形成恶性循环。有报道血脑屏障的损伤是脑缺血早期患者死亡的主要危险因素之一。因此掌握脑缺血早期血脑屏障通透性变化的规律对于临床脑缺血的治疗具有重要意义。紧密连接(tight junction, TJ)是保持BBB完整性的重要因素,由跨膜蛋白(claudin、occludin、JAM)和膜相关蛋白(ZO、AF-6、7H6)共同组成,其功能包括加强内皮细胞间连接、封闭细胞间隙、调整各种物质扩散、参与细胞生长分化的信号的传递等。分子生物学等研究证实,TJ是BBB通透性调节的中心环节,occludin、claudin-5及ZO-1是TJ的主要结构蛋白,分子量分别为60kD、22kD、220kD,其表达水平的变化与脑微血管通透性的改变及脑水肿的程度密切相关。绿茶多酚是绿茶中的主要物质。研究表明其具有很强的金属离子螯合活性,能够阻断氧自由基生成；是超氧阴离子自由基和羟自由基清除剂；能够抑制脂质过氧化反应等作用。现已证明绿茶多酚对许多疾病具有防治作用,如癌症、心血管疾病、炎性疾病以及神经变性疾病等。高文波等报道给予大鼠口服绿茶多酚对随后的缺血再灌注损伤所致的大鼠心脏结构和功能的改变具有明显的保护作用。但有关绿茶多酚对脑缺血血脑屏障通透性变化的影响还未见报道。本研究首先确定大鼠局灶性脑缺血不同时程BBB通透性的改变以及绿茶多酚对BBB通透性的影响,然后应用组织学、分子生物学等方法,证明绿茶多酚对BBB的保护作用的分子机制,为临床上治疗缺血性脑损伤提供理论基础。1、实验动物准备及分组将184只Wistar大鼠随机分为两组：绿茶多酚组(n=92)和对照组(n=92)。绿茶多酚组大鼠每日行绿茶多酚蒸馏水溶液灌胃,每日2次,给药剂量为250mg/kg体重,灌胃30天。对照组每日行同体积蒸馏水灌胃。灌胃停止后,应用Longa线栓法将上述大鼠制备成局灶性脑缺血模型,根据缺血时间的不同,将上述每组大鼠进一步分为：缺血0min组(n=23)、缺血30min组(n=23)、缺血60min组(n=23)及缺血120min组(n=23)。2、大鼠局灶性脑缺血模型的制备参照Longa线栓法栓塞大鼠左侧大脑中动脉(MCA)。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3ml/kg体重),麻醉后,将大鼠仰卧位固定在手术台上行颈部脱毛,常规消毒后在颈部正中切口,分离皮下组织,充分暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。在ECA与CCA分叉处结扎ECA,线栓采用直径为0.26mm涂有肝素的尼龙鱼线,鱼线经CCA进入ICA约18-20mm,感觉有阻力时则为阻断MCA入口,栓塞成功后固定鱼线,计时,缺血时间分别为0min、30min、60min及120min。缺血0min组大鼠行假手术仅暴露颈部血管,不实施血管栓塞。实验结束后分别留取标本备用。3、利用伊文思兰(evans blue, EB)的渗透性评估血脑屏障的通透性,透射电镜观察血脑屏障超微结构的变化。4、应用RT-PCR法检测大鼠局灶性脑缺血不同时间点紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin及claudin-5的mRNA表达水平的变化。5、应用S-P免疫组织化学法检测大鼠局灶性脑缺血不同时间点缺血区血脑屏障紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin及claudin-5的分布和表达的变化;Western blot法检测ZO-1、occludin及claudin-5的蛋白表达水平的变化。6、应用RT-PCR法和Western blot法检测大鼠局灶性脑缺血不同时间点缺血区脑组织PKCa的mRNA和蛋白表达水平的变化。结果1、应用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型,缺血60min、120min的脑组织血脑屏障通透性显著增加,透射电镜显示,同时点的脑组织血脑屏障紧密连接开放。2、绿茶多酚显著降低了缺血60min及120min大鼠脑组织的血脑屏障通透性。透射电镜显示,同时点的脑组织血脑屏障紧密连接处于关闭状态。3、RT-PCR、免疫组化和Western blot结果显示,大鼠局灶性脑缺血60min及120min脑组织紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的mRNA和蛋白表达水平显著降低,绿茶多酚显著增加了缺血60min及120min脑组织紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的mRNA和蛋白表达水平。4、大鼠局灶性脑缺血30min至120min脑组织中PKCa的mRNA和蛋白表达水平显著升高,绿茶多酚显著降低了缺血30min至120min大鼠脑组织中PKCa的mRNA和蛋白的表达水平。讨论绿茶多酚是绿茶中的主要物质,经消化道吸收后在体内分布广泛,可进入全身各种组织,包括脑组织。其主要作用包括：1.抗氧化作用；2.抗癌作用；3.防治早老性痴呆；4.神经保护作用；5.防治心血管疾病；6.防治炎性疾病；此外,绿茶多酚能够抑制MMP-2的表达和活化。Motohisa Suzuki等报道,绿茶多酚对Wistar大鼠缺血再灌注所致的神经元的损伤具有保护作用。但关于绿茶多酚对大鼠局灶性脑缺血缺血区BBB的作用还未见报道。在本研究中,我们通过预先给予大鼠口服绿茶多酚,然后依据Longa法建立大鼠MCAO模型,观察绿茶多酚对大鼠脑缺血BBB通透性变化的影响。伊文思蓝(EB)渗透法是评价血脑屏障开放程度的常用方法。我们通过检测缺血区脑组织的EB含量发现,大鼠在脑缺血60min时缺血区BBB通透性开始升高,缺血120min BBB通透性显著升高；而且在大鼠脑缺血2h之内,随着缺血时间的延长,缺血区脑组织BBB通透性逐渐升高,BBB通透性的改变呈单相变化。通过透射电镜观察了大鼠缺血区BBB的超微结构发现：缺血60min时BMECs的部分TJ开放和吞饮小泡数量增多；缺血120min TJ明显开放,可见内皮细胞核溶解；而绿茶多酚组大鼠未见TJ开放。上述结果提示,绿茶多酚对局灶性脑缺血大鼠缺血区BBB具有保护作用,此保护作用可能与绿茶多酚对TJ的作用有关。分子生物学研究证实,TJ是BBB通透性调节的中心环节,ZO-1、occludiin、claudin-5是构成TJ的主要结构蛋白,其表达水平的变化与脑微血管通透性的改变及脑水肿的程度密切相关。现已证实,缺血再灌注损伤造成的BBB通透性增加的主要机制之一是由于组成TJ的相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的合成及表达减少,破坏了TJ的完整性,从而导致BBB的通透性增加。为了进一步在分子水平上阐述绿茶多酚降低缺血大鼠BBB通透性的机制,我们应用RT-PCR、Western blot及免疫组织化学法检测了BBB紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的mRNA及蛋白表达水平的变化。RT-PCR和Western blot的结果显示对照组大鼠在缺血60min及缺血120min时,ZO-1、occludin、claudin-5的mRNA和蛋白表达水平明显降低；而绿茶多酚组大鼠缺血60min与缺血120min的ZO-1、occludin、claudin-5的mRNA和蛋白表达水平较同时点对照组明显升高。免疫组织化学结果显示,在缺血区脑组织,随着缺血时间的延长ZO-1、occludin、claudin-5的表达逐渐减少,而绿茶多酚组大鼠缺血60min组及缺血120min组分别与对照组缺血60min组及缺血120min组相比ZO-1、occludin、claudin-5的表达明显增加；上述结果提示绿茶多酚能够在转录水平及翻译水平增强紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的合成及表达,从而降低了BBB的通透性。PKC是TJ形成和正确组装的重要的调节因子之一。研究表明,PKC的激活在血管内皮细胞屏障功能和通透性的调节中起着重要的作用。PKC的激活和移位可以直接或间接地作用于内皮细胞骨架蛋白,导致内皮细胞骨架重排,引起血管通透性的升高。PKCα的活化能够导致BBB通透性的增加,而抑制PKCα则可阻断MCP-1诱导的BBB通透性的增加。PKC可引起TJ相关蛋白磷酸化。使用PKC激动剂后,其下游的激酶或磷酸化酶激活,导致已磷酸化的occludin去磷酸化,引起TJ通透性升高。在缺氧、低血糖等情况下,血管内皮细胞之间的通透性升高,这种作用可被PKC抑制剂H7所阻断。产气荚膜杆菌毒素A可引起细胞间通透性升高,实验观察到毒素A能够激活质膜和胞浆的PKCa,导致occludin去磷酸化、ZO-1移位,TJ通透性升高。在低氧/血糖缺乏的情况下,脑微血管内皮细胞PKC的α,βI和ε亚型表达增加,而在低氧过程中PKC的α,βI和ε亚型表达增加,通常伴有脑内皮细胞细胞旁通路通透性的升高。在本研究中,我们检测了各组大鼠缺血脑组织中PKC。的mRNA及蛋白的表达,结果显示,缺血30min PKCa的mRNA及蛋白表达水平升高；缺血60min组PKCa的mRNA及蛋白表达水平明显升高,而缺血120min组PKCα的mRNA及蛋白表达水平则显著升高；上述结果提示大鼠局灶性脑缺血BBB通透性升高与PKCα相关。而绿茶多酚组大鼠在缺血60min及缺血120min时的PKCa的mRNA及蛋白表达水平较同时点对照组显著降低,说明绿茶多酚能够降低PKCa的mRNA及蛋白的表达,这可能是绿茶多酚使ZO-1,occludin, claudin-5的mRNA和蛋白表达增强的原因之一。综上所述,绿茶多酚对大鼠局灶性脑缺血血脑屏障的完整性具有保护作用,其可能的机制之一是绿茶多酚能够在转录及翻译水平增强TJ相关蛋白ZO-1,occludin及claudin-5的合成与表达,此过程可能与绿茶多酚降低PKCα的合成与表达相关。结论1、大鼠局灶性脑缺血2h,随着缺血时间的延长,血脑屏障通透性逐渐增加,缺血60min、120min时显著增加,同时伴有血脑屏障紧密连接的开放,及缺血区脑组织紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的mRNA和蛋白表达水平的显著降低。2、绿茶多酚显著降低了缺血60min及120min大鼠脑组织的血脑屏障通透性,对血脑屏障的完整性具有一定的保护作用。3、绿茶多酚显著增加缺血脑组织紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的mRNA和蛋白表达水平是绿茶多酚降低缺血大鼠脑组织血脑屏障通透性,对血脑屏障的完整性起到保护作用的可能机制之一。4、绿茶多酚对TJ相关蛋白的影响可能与绿茶多酚降低PKCa的合成与表达相关。