论文部分内容阅读
背景:弓形虫(Toxoplasma gondii)是属于原生动物顶复门的一种细胞内专性寄生虫,有复杂的生活史,可以在哺乳动物包括人类中引起广泛的传播。弓形虫的容许细胞十分广泛,能感染几乎所有的有核细胞,但其对神经细胞有着很强的亲和力。弓形虫脑炎是由于潜伏的隐性感染弓形虫活化为快速增殖的速殖子,进而对脑组织产生损伤。我们之前发现内质网(ER)相关蛋白RTN1-C是弓形虫棒状体激酶ROP18磷酸化的底物,并且ROP18磷酸化RTN1-C后通过内质网应激(ERS)来促进神经细胞凋亡。本研究中,我们预测并证实了ROP18磷酸化RTN1-C上第7、134位点的丝氨酸(Ser)和第4、8、118位点的苏氨酸(Thr),磷酸化的RTN1-C能够抑制组蛋白去乙酰酶(HDAC)活性,促使葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的乙酰化修饰,高乙酰化的GRP78使未折叠蛋白反应(UPR)的过度活化并导致ERS相关的凋亡发生,这可能是弓形虫脑炎过程中神经细胞凋亡的一个重要机制。目的:探究弓形虫ROP18与宿主RTN1-C相互作用参与神经细胞凋亡的具体分子机制,为弓形虫脑炎的研究提供新的机制。方法:通过组织染色证明弓形虫ROP18促进神经细胞凋亡;通过质谱分析、免疫沉淀(IP)、pull-down、细胞免疫荧光证明ROP18与RTN1-C直接相互作用;通过IP、体外磷酸化实验和生物信息学分析证明ROP18磷酸化RTN1-C第7、134位点的Ser和第4、8、118位点的Thr;流式细胞技术和免疫印迹等证明弓形虫ROP18通过ERS相关凋亡通路促进神经细胞凋亡;HDAC活性检测和IP说明ROP18磷酸化RTN1-C抑制HDAC活性,进而增强GRP78的乙酰化并促进神经细胞凋亡。结果:1.弓形虫ROP18诱导小鼠神经细胞凋亡。(1)HE染色:用环磷酰胺处理感染Pru株包囊的小鼠,发现小鼠大脑中Pru株包囊活化,并且活化的Pru株包囊周围的神经细胞发生炎症和坏死。(2)组织免疫荧光:用环磷酰胺处理感染Pru株包囊的小鼠,发现与未处理的小鼠相比,给药处理的小鼠大脑中Pru株包囊活化,且周围的神经细胞中caspas e-3的活化明显升高。(3)组织免疫荧光:BALB/c小鼠用以下虫子感染:过表达ROP18的RH虫株(ROP18-WT RH)、过表达激酶失活型ROP18的RH虫株(ROP18-KD RH)、敲除ROP18 RH虫株(Δrop18 RH)和野生型RH速殖子,急性期感染发病后取小鼠脑组织通过组织免疫荧光实验发现ROP18-WT RH能明显增强神经元caspase-3的活化。2.证明RTN1-C是ROP18相互作用的宿主蛋白。(1)质谱分析:用人类SH-SY5Y细胞裂解液与纯化后的GST-ROP18孵育得到能与ROP18直接相互作用的蛋白,将蛋白条带切下进行质谱分析。发现在中枢神经系统内高表达的RTN1-C能与ROP18直接相互作用。(2)Pull-down实验:分别将表达的RTN1-C-FLAG和△20-RTN1-C-FLAG与纯化的ROP18-GST进行pull-down实验,发现ROP18只能与全长的RTN1-C产生相互作用而不能和缺失氨基端20个氨基酸的RTN1-C相互作用。(3)Co-IP实验:将ROP18-GFP转染到Neuro2a细胞中用GFP抗体进行IP实验,发现ROP18能与细胞内源性RTN1-C产生相互作用。(4)细胞免疫荧光:使用过表达ROP18的ROP18-Ty1 RH虫株感染Neuro2a细胞,进行细胞免疫荧光实验发现ROP18能与神经细胞内源性RTN1-C共定位。(5)IP实验,SH-SY5Y神经细胞分别感染Δku80ΔhxgprtRH和Δrop18 RH虫株,用RTN1-C抗体做IP,证明虫体表达的ROP18与神经细胞内的RTN1-C相互作用。3.ROP18磷酸化RTN1-C Ser第7、134和Thr第4、8、118位点。(1)生物信息学分析预测发现ROP18磷酸化RTN1-C第7、134Ser和第4、8、118的Thr位点。(2)IP实验:首先,将RTN1-C-FLAG分别和ROP18-WT-GFP、ROP18-KD-GFP共转染到Neuro2a细胞中,进行IP实验发现野生型ROP18和激酶失活型ROP18均能与RTN1-C相互作用,但是只有野生型ROP18使其磷酸化。其次,将ROP18-GFP分别和RTN1-C-WT、RTN1-C-5A(RTN1-C非磷酸化型突变体,SS7/134AA+TTT4/8/118AAA)同时转染到Neuro2a细胞中,进行IP实验发现野生型ROP18只能磷酸RTN1-C-WT,而不能磷酸化RTN1-C-5A突变体。最后将ROP18-GFP与△20-RTN1-C共转染到Neuro2a细胞中进行IP实验发现ROP18不能磷酸化缺失了氨基端20个氨基酸的RTN1-C。(3)体外磷酸化实验:将RTN1-C-WT和RTN1-C-5A转染到Neuro2a细胞中,进行体外磷酸化实验发现只有RTN1-C-WT能被磷酸化,而RTN1-C-5A突变体不能被磷酸化。4.ROP18通过磷酸化RTN1-C介导ERS相关凋亡通路促进神经细胞凋亡。(1)Neuro2a细胞经caspase-12特异性抑制剂2-ATAD-FMK处理后,分别感染ROP18-WT RH、ROP18-KD RH和野生型RH虫株。通过免疫印迹发现ROP18-WT RH促进了caspase-12和caspase-3的活化以及CHOP蛋白的表达。而使用了特异性抑制剂2-ATAD-FMK处理后,能有效降低caspase-12和caspase-3的活化。(2)流式细胞技术:分别将RTN1-C-WT、RTN1-C-5D和RTN1-C-5A转染到Neuro2a细胞中,进行流式细胞检测,发现RTN1-C-WT和RTN1-C-5D促进细胞凋亡,同时免疫印迹也证明RTN1-C-WT和RTN1-C-5D增加了caspase-12和caspase-3的活化。5.ROP18磷酸化RTN1-C下调HDAC活性以诱导细胞凋亡。(1)HDAC活性检测:分别将RTN1-C-WT、RTN1-C-5D和RTN1-C-5A转染到Neuro2a细胞中,进行HDAC活性检测,发现RTN1-C-WT和RTN1-C-5D能抑制细胞中HDAC的活性。(2)IP实验:分别将RTN1-C-WT、RTN1-C-5D和RTN1-C-5A转染到Neuro2a细胞中,进行IP实验,发现转染了RTN1-C-WT和RTN1-C-5D能使细胞的HDAC的活性降低和GRP78乙酰化增加,同时发现GRP78能与HDAC3相互作用。结论:本实验通过免疫荧光,免疫印迹,流式细胞技术,IP,pull-down,质谱等实验证明了弓形虫蛋白ROP18能与宿主RTN1-C相互作用并使其磷酸化,磷酸化的RTN1-C抑制HDAC3的活性从而增加GRP78乙酰化,通过ERS使神经细胞凋亡率升高,这可能是弓形虫脑炎过程中神经细胞凋亡的一个重要机制。