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目的:探究金雀异黄素（genistein,GEN）对脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）活化的巨噬细胞凋亡的影响及是否与调节TIPE2/Akt通路有关。方法:1.将1 000 ng·mL-1LPS作用于RAW264.7细胞24 h,采用RT-qPCR检测IL-6和TNF-αmRNA表达水平,Western Blot检测iNOS和COX-2蛋白表达情况,构建LPS活化巨噬细胞模型。使用GEN（10μM）分别预孵育RAW264.7细胞1h、2 h、4 h、8 h,再和LPS(1 000 ng·mL-1)共处理24 h,CCK8检测细胞活力,RT-qPCR和Western Blot分别检测凋亡蛋白Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-8 mRNA与蛋白表达,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率,TUNEL染色检测细胞凋亡指数,研究GEN对LPS活化巨噬细胞凋亡的影响。TIPE2是一种免疫负性调控因子,为明确TIPE2在GEN调控巨噬细胞凋亡中所起的调控作用,使用GEN孵育RAW264.7细胞2 h,再用LPS处理24 h,RT-qPCR检测TIPE2基因表达,Western Blot检测TIPE2、Akt、p-Akt蛋白表达,Immunofluorescence检测TIPE2表达,观察GEN对活化巨噬细胞TIPE2表达及Akt磷酸化的影响。2.分别使用TIPE2过表达或敲降慢病毒颗粒感染RAW264.7细胞,嘌呤霉素进行筛选,荧光显微镜下观察GFP蛋白表达情况,RT-qPCR、Western Blot检测TIPE2基因及蛋白表达,建立稳定细胞系。采用LPS孵育各细胞系24 h,CCK8试剂盒测定细胞活力,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率,TUNEL检测细胞凋亡指数,Western Blot检测Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-8、Akt、p-Akt蛋白表达,研究TIPE2对活化巨噬细胞凋亡及Akt磷酸化的影响。IGF-1(100 ng·mL-1)预处理TIPE2过表达细胞2 h,再与LPS共处理24 h,CCK8试剂盒测定细胞活力,Western Blot检测Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-8蛋白表达,验证TIPE2对活化巨噬细胞Akt磷酸化的影响。3.GEN孵育稳定敲降TIPE2细胞系2 h,再与LPS共处理24 h,CCK8试剂盒测定细胞活力,Western Blot检测Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-8蛋白表达。IGF-1、GEN联合处理RAW264.7、稳定敲降TIPE2、稳定过表达TIPE2细胞系2 h,再与LPS共孵育24 h,CCK8试剂盒测定细胞活力,Western Blot检测Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-8蛋白表达,研究GEN是否通过TIPE2/Akt通路影响LPS活化巨噬细胞凋亡。结果:1.LPS(1 000 ng·mL-1)处理RAW264.7细胞24 h,IL-6和TNF-αmRNA表达上调,iNOS和COX-2蛋白表达增加,说明LPS能有效活化RAW264.7细胞,可用于后续实验。与对照组比较,LPS显著增加巨噬细胞活力,降低细胞凋亡率和凋亡指数,减少凋亡蛋白Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Cleaved caspase-8表达,增加Bcl-2表达。GEN呈时间依赖性明显降低活化巨噬细胞活力,升高细胞凋亡率和凋亡指数,促进Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Cleaved caspase-8表达,抑制Bcl-2表达,且GEN作用2 h即能有效促进活化巨噬细胞凋亡（P<0.05）,因此我们选用2 h作为GEN的处理时间。与对照组比较,LPS明显下调TIPE2 mRNA及蛋白表达,上调p-Akt水平,Akt无明显变化;GEN对未活化细胞TIPE2、Akt、p-Akt表达均无明显影响,而GEN可显著增加活化巨噬细胞TIPE2基因及蛋白表达水平,减少p-Akt表达,不影响Akt表达变化。2.与TIPE2空载体组比较,TIPE2过表达组细胞TIPE2表达上调约2倍,TIPE2敲降组细胞TIPE2表达下调约70%。TIPE2过表达显著抑制活化巨噬细胞活力,提高凋亡率和凋亡指数,减少p-Akt、Bcl-2表达,增加Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Cleaved caspase-8表达;IGF-1可有效逆转TIPE2过表达对活化巨噬细胞活力及凋亡蛋白的作用。TIPE2敲降能明显促进活化巨噬细胞活力,降低凋亡率和凋亡指数,增加p-Akt、Bcl-2表达,减少Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Cleaved caspase-8表达。3.与TIPE2空载体+GEN+LPS组比较,TIPE2敲降+GEN+LPS组细胞活力增加,Bcl-2表达增多,Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Cleaved caspase-8表达减少。与LPS组相比,LPS+IGF-1组细胞活力及Bcl-2表达显著增加,Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Cleaved caspase-8表达减少;与LPS+GEN组比较,LPS+GEN+IGF-1组细胞活力、Bcl-2表达均明显增加,Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Cleaved caspase-8表达减少。与RAW264.7+GEN+LPS组比较,TIPE2过表达+GEN+LPS组细胞活力减弱,Bcl-2表达减少,Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Cleaved caspase-8表达增多,而TIPE2过表达+GEN+LPS+IGF-1组与TIPE2过表达+GEN+LPS组结果相反;与RAW264.7+GEN+LPS组比较,TIPE2敲降+GEN+LPS组细胞活力增强,Bcl-2表达增加,Cleaved caspase-3、CHOP、Bax、Cleaved caspase-8表达减少,而TIPE2敲降+GEN+LPS+IGF-1组比TIPE2敲降+GEN+LPS组结果更为明显。结论:GEN可能通过上调TIPE2表达,抑制Akt磷酸化,促进LPS活化的巨噬细胞凋亡。