TPO是新近发现的一个十分重要的造血细胞生长和发育的调控因子，它能特异性促进巨核细胞增殖、分化及血小板成熟，因而在临床上治疗由于血小板减少而引发的各类疾病中具有重要的应用价值。为了研究TPO内含子和5’非翻译区对其表达的影响，拟利用RT-PCR和长距离PCR技术从中国人胎肝组织中分别扩增全长人TPOcDNA，6.2kb的TPO基因组DNA以及TPO基因中不同的内含子。首先，以胎肝mRNA为模板，应用RT-PCR技术分两段扩增并克隆了人全长约1.0kb的TPO cDNA分子，序列分析表明：该TPO cDNA分子中缺失编码Leu¹³³～GIy¹³⁷的15个碱基。资料表明，这种缺失体存在于正常的人体内，是由于TPO mRNA的不同剪接造成。为此，参照已发表的TPO cDNA序列，人工合成包含上述缺失核苷酸序列的DNA片段，重新获得全长TPO cDNA。其次，利用常规PCR和长距离PCR技术，从胎肝组织中分别克隆了6.2kb的TPO基因组和TPO基因组中的内含子Ⅰ，内含子Ⅱ～Ⅳ和内含于Ⅴ，全序列分析表明，已扩增的TPO产物中，所有编码序列，全部内含子/外显子剪切部位序列同文献报道一致，在内含子中有几个碱基同文献报道不一致，这可能由于个体差异或突变造成。 为了在细胞和动物个体水平上研究TPO基因5’非翻译区和不同内含子对TPO表达的影响，在已获得了全长人TPOcDNA、TPO基因组DNA以及TPO基因中不同内含子的基础上，构建了以CMV、大鼠WAP、山羊β-casein基因调控的各类TPO真核表达质粒（共16种），并经脂质体转染，在COS-1细胞、HC-11细胞上获得了瞬间表达。结果表明：在转染48小时后，各类TPO重组质粒的表达顺序为：TPO gDNA＜TPO intronⅠ＜△TPO intronⅠ＜TPOcDNA＜TPO intron Ⅴ。这一结果提示：①在TPO基因组中，最后一个内含子可显著提高TPO的表达水平，表明其可能含有特殊的增强序列；②在TPO基因组中可能存在抑制TPO高水平表达的结构元件，造成TPO基因组在细胞中不表达或低水平表达。 根据上述细胞水平上的表达结果，选用门种以大鼠 PAP、卜casein基因调控的Top重组表达质粒通过显微注射法制备了转基因小鼠。通过PCR和／或Southern印迹筛选己整合TPO基因的阳性转基因鼠，通过高灵敏度ELISA方法检测泌乳期阳性转基因鼠乳汁中N 含量，结果表明：①在以WAP／TPO融合基因制备的6种转基因鼠中，外源基因平均的整合率为10～15％，有5只雌性转基因阳性鼠乳汁中有人P 的表达，表达水平为400pg／ml～2000pg／ml，其中以含有TPO最后一个内含子的转基因鼠表达水平最C高，其表达量分别为 2307pg加l和 1307pg／ml。②在以 D－casein／TPO融合基因制备的5种TPO转基因鼠中，外源基因的平均整合率为3～23％，有7只雌性转基因阳性鼠乳汁中有人w 的表达，表达水平为＊／ml～146ng／ml，其中以含有P 最后一个内含子的转基因鼠表达水平最高，其表达量为 146 ng／ml。这一结果进一步证明：①在TPO基因组中，最后一个内含子可显著提高TPO的表达水平，表明其可能含有特殊的增强序列：②在TPO基因组中可能存在抑制TPO高水平表达的结构元件，造成TPO基因组在细胞中不表达或低水平表达。③p－casein基因调控序列可指导TPO基因在转基因动物乳腺中高水平表达。