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胃癌(gastric cancer,GC)是全世界最为常见的恶性肿瘤之一,特别是在我国,胃癌的发病率和死亡率逐年增加,防治形势尤为严峻。目前,对于包括胃癌在内的恶性肿瘤的发生发展机制尚未阐明,而深入研究胃癌发生发展、侵袭转移的分子机制,对于实现胃癌的早期诊断、分子分型、治疗策略选择及预后的预测等基础和临床工作具有重要的理论意义和直接的指导价值。研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)异常表达变化与肿瘤的发生、发展密切相关。在胃癌中亦发现存在异常调控的miRNA分子,参与了胃癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移,并可通过调控不同肿瘤相关的靶基因,改变对放化疗的敏感性。已有研究表明:胃癌患者肿瘤组织中miR-198表达显著下调。miR-198低表达与胃癌肿瘤转移早、患者生存期短具有相关性。深入研究miR-198及其作用靶基因的功能有助于阐明胃癌发生发展的分子机制和提供潜在的治疗靶点。但miR-198在胃癌发生发展及预后中的具体作用及其分子机制尚不清楚。本实验研究miR-198在胃癌细胞中的表达及及其作用靶点,为临床针对胃癌诊断、治疗及预后评估提供可靠的实验依据。主要进行以下三方面的研究:一、miR-198异常表达对胃癌细胞生物学特性和移植瘤的影响;二、miR-198作用靶基因的筛选及其靶向作用验证;三、CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除胃癌细胞miR-198候选的靶基因,验证该基因敲除后对胃癌细胞增殖、凋亡等生物学效应的影响。第一部分miR-198异常表达对胃癌细胞生物学特性和移植瘤的影响方法:1.采用实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR,qPCR)比较胃癌细胞SGC-7901与正常胃黏膜上皮细胞GES-1 miR-198的表达水平。2.构建miR-198慢病毒表达载体并转染胃癌细胞,筛选鉴定稳定表达miR-198的胃癌细胞;3.利用MTT、平板克隆形成、流式细胞术、细胞划痕及Transwell迁移实验,研究miR-198过表达对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移等生物学特性的影响。4.利用稳定表达miR-198的胃癌细胞对裸鼠皮下注射进行移植瘤成瘤实验,观察miR-198过表达对荷瘤小鼠肿瘤增殖的影响。结果:1.qPCR实验结果表明,miR-198在胃癌细胞中的表达水平明显降低(P<0.05)。2.与转染慢病毒空载体对照组(空载体组)相比,转染慢病毒表达载体miR-198组胃癌细胞中(miR-198转染组)miR-198的表达量显著升高(P<0.05),miR-198稳定表达的胃癌细胞成功建立。3.miR-198过表达可明显抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖、侵袭和迁移(P<0.05),同时促进肿瘤细胞的凋亡(P<0.05)。在胃癌细胞系SGC-7901中,MTT检测24h、48h、72h、96h时空载体组OD450nm 的值分别为 0.678±0.074、1.113±0.091、1.813±0.157 和 3.107±0.189,miR-198 转染组 OD450nm 的值分别为 0.474±0.039、0.735±0.085、1.159±0.148和1.710±0.261(P<0.05);克隆形成实验SGC-7901细胞对照组克隆形成数为232±21,空载体组克隆形成数为201±246,miR-198转染组克隆形成数分别为139± 11(P<0.05);Transwell侵袭实验空载体组侵袭细胞数为212± 14,miR-198转染组侵袭细胞数为161±17(P<0.05)。4.接种稳定表达miR-198的胃癌SGC-7901细胞组裸鼠的移植瘤生长速度明显减慢,miR-198组的肿瘤体积(854.01±58.20mm3)显著小于未转染的胃癌SGC-7901细胞对照组(2589.28±119.60mm3)和转染空载体的SGC-7901细胞组(2336.75±161.80mm3),差异有统计学意义(P<0.05)。小结:1.miR-198在胃癌细胞中呈低水平表达。2.miR-198的表达上调可显著抑制胃癌细胞的生长增殖、侵袭和迁移,并可抑制裸鼠移植瘤的生长。第二部分miR-198靶基因的筛选及其靶向作用验证方法:1.采用高通量蛋白抗体芯片技术筛选胃癌组织中差异表达的细胞因子。采用生物信息学技术分析筛选miRNA-198作用候选靶基因。2.构建TLR43’-UTR荧光素酶报告基因载体,验证miR-198与候选基因的靶向调控关系。3.利用qPCR、Western blot检测候选靶基因在胃癌细胞和转染miR-198的胃癌细胞中的表达情况。结果:1.蛋白芯片检测和生物信息学分析结果表明,与癌旁组织相比,在胃癌组织中显著差异表达蛋白因子共105种(P<0.05)。KEGG功能富集(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes即:京都基因与基因组百科全书)分析结果显示鉴定出的105种蛋白参与了多种信号传导和重要生物学功能。结合三个miRNA数据库(Target Scan、Pictar、Diana)预测分析miR-198作用的靶基因,结果提示在105种差异表达的蛋白中有六种细胞因子为miR-198潜在的靶基因:生长分化因子 1、5 和 11(GDF1,5,11)、TLR4(Toll-likereceptors4)、人 Fas相关细胞死亡结构域蛋白(FADD)和表皮生长因子(EGF)。经过生物信息学分析结合实验证实TLR4在肿瘤发生发展中的作用,选定TLR4作为miRNA-198作用的候选靶基因。2.通过双荧光色素酶报告基因检测发现,当共转染miR-198和野生型TLR43’-UTR的报告基因载体时,荧光素酶活性显著降低;而当共转染miR-198和突变型TLR4 3’-UTR的报告基因载体时,荧光素酶活性没有明显变化。实验结果miR-198可以和TLR43’-UTR位点结合,表明TLR4是miRNA-198调控的下游靶基因。3.qPCR实验结果表明,胃癌SGC-7901细胞中TLR4基因的表达明显升高,而转染miR-198的胃癌SGC-7901中TLR4基因的表达明显降低。Western Blot检测结果,miR-198过表达能够抑制TLR4的表达,表明miRNA-198在转录水平负调控TLR4的表达。小结:1.生长分化因子1、5和11(GDF1,5,11)、TLR4、人Fas相关细胞死亡结构域蛋白(FADD)和表皮生长因子(EGF)在胃癌组织中表达显著上调。2.TLR4基因是胃癌细胞中miR-198下游调控的靶基因,miRNA-198负调控TLR4的表达。第三部分TLR4基因敲除对胃癌细胞生物学特性的影响方法:1.针对TLR4基因的DNA序列设计靶向人TLR4基因第2个外显子的向导RNA(sgRNA),克隆入px330载体,构建pSpCas9(BB)载体。将测序及酶切鉴定正确的重组质粒转染胃癌SGC-7901细胞,筛选并继续培养单克隆细胞。2.PCR测序鉴定TLR4基因敲除效果;Western blot方法检测细胞中的TLR4基因敲除后蛋白表达水平。3.MTT实验检测TLR4基因敲除胃癌细胞增殖的影响。4.流式细胞术检测TLR4敲除胃癌细胞系凋亡的影响。5.Transwell小室实验检测TLR4基因敲除胃癌细胞侵袭的影响。结果:1.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得敲除TLR4基因的单克隆胃癌细胞,PCR测序鉴定敲除成功。2.Western blot结果显示:同胃癌细胞SGC-7901野生型细胞相比,SGC-7901-TLR4-KO单克隆细胞中未检测到TLR4蛋白的表达。3.MTT实验结果表明,与正常胃癌细胞相比,LLR4基因敲除后的胃癌细胞生长较为缓慢,细胞增殖减弱(P<0.05)。4.TLR4基因可诱导胃癌细胞的凋亡,并可抑制胃癌细胞的侵袭(P<0.05)。小结:1.敲除TLR4基因可促进胃癌细胞的凋亡,抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。全文结论1.miR-198在胃癌细胞中呈低水平表达,miR-198的表达上调可显著抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。2.miR-198过表达可有效抑制裸鼠移植瘤的生长。3.TLR4基因为miR-198在胃癌细胞中调控的靶基因。4.miR-198负调控TLR4基因抑制胃癌细胞的增殖和迁移。