目的:编码神经突生长抑制因子B受体（Neurite outgrowth inhibitor-B receptor,NgBR）的NUS1基因是2018年在我国帕金森病（Parkinson’s disease,PD）人群中发现的PD新风险基因,且在我国PD人群中NUS1基因编码的蛋白NgBR的表达水平显著降低。PD是一种常见的与年龄相关的神经退行性疾病,它的主要症状是由黑质-纹状体多巴胺（Dopamine,DA）能神经元选择性变性导致纹状体神经元突触末端神经递质DA的消耗和最终丧失引起。错误折叠蛋白质在大脑DA能神经元中大量积累是PD的重要病理机制之一。内质网（Endoplasmic reticulum,ER）是蛋白质折叠的场所,当错误折叠的蛋白大量积累时会导致ER应激。ER应激反应激活未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）适应性保护机制,改善蛋白质折叠,提高质量控制机制,促进错误折叠蛋白降解和维持蛋白稳态。NgBR在中枢神经系统的分布、功能及其功能障碍所致的DA能神经元变性的机制并不清楚,内质网定位的NgBR是否调控ER应激以及如何调节ER应激的分子机制还有待研究。方法:首先分离提取小鼠中脑、皮层、纹状体和脑干等脑区组织蛋白,以及分离和培养小鼠原代皮层神经元、原代星形胶质细胞和原代小胶质细胞,用蛋白免疫印迹法检测NgBR在各个脑区及不同类型细胞中的表达水平。为了观察NgBR的亚细胞定位,在细胞中转染带有Flag标签的Flag-NgBR质粒,用激光共聚焦显微镜拍摄Flag-NgBR与内质网、线粒体、高尔基体以及溶酶体的共定位。再通过两种小干扰RNA（siRNA）靶向沉默NUS1基因的表达,构建NgBR缺失细胞模型。通过RNA转录组测序（RNAseq）和差异分析,筛选出NgBR缺失后表达改变的基因,再对这些差异基因进行富集通路分析,筛选出NgBR缺失后主要影响的细胞过程和信号通路。然后使用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）对筛选结果进行验证。通过蛋白免疫印迹法检测ER应激相关蛋白:磷酸化蛋白激酶RNA 样 ER 激酶（Protein kinase RNA-like ER kinase,PERK）、磷酸化肌醇需要蛋白lα（Inositol-requiringprotein 1α,IRE1α）、磷酸化真核翻译起始因子2亚基-α（Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit-α,eIF2α）、激活转录因子 4（Activating transcription factor-4,ATF4）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）以及伴侣葡萄糖调节蛋白78/结合免疫球蛋白（Glucose-regulated protein 78/Binding immunoglobulin protein,GRP78/BIP）的表达水平,检测ER应激诱导情况及其相关的信号通路。为了进一步研究NgBR缺失诱导ER应激的相关信号通路,使用PERK抑制剂GSK2606414和ATF6抑制剂Ceapin-A7分别处理NgBR缺失的Neuro-2a（N2a）细胞,然后用蛋白免疫印迹法检测ER应激相关蛋白的表达水平。接下来为了研究NgBR缺失诱导ER应激是否依赖NgBR参与调节蛋白质糖基化和胆固醇运输的功能,首先在N2a细胞中沉默NgBR后过表达Flag-DHDDS或使用抑制胆固醇聚集的药物羟丙基-β-环糊精（2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HP-β-CD）处理细胞,然后通过蛋白免疫印迹法检测磷酸化PERK、ATF4、CHOP和BIP蛋白表达水平。此外,在过表达Flag-NgBR的N2a细胞中用ER应激诱导剂衣霉素（Tunicamycin,TM）处理0、2、4、8、12及24小时后用蛋白免疫印迹法检测ER应激相关蛋白的表达水平。通过结合质谱组学（IP-MS）筛选出与NgBR结合的内质网蛋白,然后通过免疫共沉淀实验和体外结合实验进行验证。同时还使用激光共聚焦显微镜拍摄NgBR与结合蛋白的共定位进一步验证。为了进一步探索ER应激对NgBR表达的影响,在N2a、HEK293、SH-SY5Y细胞中用ER应激诱导剂TM和毒胡萝卜素（Thapsigargin,TG）处理0、2、4、8、12及24小时后用蛋白免疫印迹法检测NgBR的表达水平,同时用qRT-PCR检测TG和TM处理8小时后Nus1的mRNA水平变化。此外,在细胞中分别过表达ER应激信号通路中的关键转录因子:Flag-ATF4、Flag-CHOP、Flag-Xbp1s（X-box binding protein 1,Xbp1）和 Flag-ATF6f（Activating transcription factor 6,ATF6）,然后采用蛋白免疫印迹法检测这些转录因子对NgBR蛋白表达水平的影响。并且构建了 NUS1基因启动子荧光素酶报告基因质粒,利用双荧光素酶报告基因,检测这些转录因子对NUS1基因启动子活性的调控。结果:NgBR在小鼠的中脑、皮层、纹状体和脑干中均广泛表达,且在小鼠原代神经元和原代小胶质细胞中表达丰度较高。亚细胞定位发现NgBR主要定位在内质网。RNAseq分析结果显示NgBR缺失后内质网蛋白加工通路的众多基因表达发生变化,其中ER应激相关基因表达显著升高。在N2a细胞和BV2细胞中敲低NgBR后,ER应激相关蛋白ATF4、CHOP和BIP蛋白水平明显升高。在原代神经元中缺失NgBR后,Atf4和Chop的mRNA水平也显著升高。这些结果说明NgBR缺失会诱导ER应激和UPR。接下来我们发现NgBR缺失后磷酸化PERK和磷酸化eIF2α的蛋白水平显著增加,而磷酸化IRE1α和总PERK蛋白水平没有明显变化。在使用PERK抑制剂GSK2606414处理后缓解了 NgBR缺失引起的PERK磷酸化水平及ATF4和CHOP蛋白水平的增加,但对BIP的蛋白水平没有明显影响;使用ATF6抑制剂Ceapin-A7可以缓解了 NgBR缺失所致的BIP蛋白水平增加。这些结果验证了 NgBR缺失是通过PERK-ATF4-CHOP和ATF6-BIP两条通路诱导ER应激。而在N2a细胞中缺失NgBR后过表达Flag-DHDDS或使用HP-β-CD处理后并没有缓解ER应激相关蛋白表达水平。说明NgBR缺失导致的ER应激不依赖NgBR参与调节蛋白质糖基化和胆固醇运输的功能。我们通过对结合质谱组学的筛选结果分析发现,PERK是NgBR潜在的相互作用蛋白,我们通过免疫共沉淀和体外pulldown实验证实了二者存在直接结合作用,并且NgBR与PERK共定位在内质网。值得注意的是,NgBR与PERK的失活突变体PERK-K622A不存在结合作用,并且过表达Flag-NgBR可以缓解TM诱导引起的PERK磷酸化,提示NgBR可能通过结合PERK而抑制PERK的磷酸化。此外,我们也发现ER应激也调控NgBR的转录表达。在N2a、HEK293和SH-SY5Y细胞中用ER应激诱导剂TG和TM处理0、2、4、8、12和24小时等不同时间后,NgBR的蛋白水平显著升高,并呈现一定的时间依赖性。qRT-PCR的结果也表明在TG或TM处理8小时后Nus1的mRNA水平显著升高。双荧光素酶报告基因实验和蛋白免疫印迹实验证实了 ER应激信号通路中的关键转录因子ATF4、CHOP、ATF6f及Xbp1s均不同程度地诱导NgBR的表达,其中NgBR的转录表达主要受到ATF6f的诱导,且无论人源和鼠源NUS1/Nus1基因启动子上都有非常保守的ATF6f的反应元件,提示NgBR的转录表达可以被ER应激中的ATF6通路激活。结论:NgBR与ER蛋白质稳态有密切关联。一方面,NgBR对ER应激和UPR有重要的调控作用,NgBR缺失会诱导ER应激,通过PERK-ATF4-CHOP和ATF6-BIP两条通路激活UPR。另一方面,NgBR的转录表达显著被ER应激和UPR的ATF6通路激活。NgBR缺失诱导的ER应激可能是NgBR缺失介导的DA能神经退变的机制之一。