一研究背景现代研究认为,胃粘膜防御体系是一个多级复杂体系,主要可以分为三级。在这三级防御体系中,每一级体系都涉及到了各种细胞因子,它们在胃粘膜防御体系中发挥了重要作用,并且这些因子互相影响,相互作用。三叶因子1(TFF1)是三叶家族成员之一,拥有高度保守的三叶肽结构,相当稳定,耐酸、耐热分解。有研究发现,在空肠中过度表达人类TFF1的转基因小鼠,胃肠道中诱发溃疡的发生率偏低,提示TFF1在胃肠道的修复和防护中发挥了重要作用。粘蛋白是一组高度糖基化的不同糖蛋白的总称,在胃粘膜的防御和修复过程中扮演着重要的角色。正常状态下,TFF1通过与MUC5AC粘蛋白结合或与其相应受体或转运蛋白结合发挥生理功能。促进细胞迁移是胃粘膜修复重建过程的重要步骤,TFF1在促细胞移行过程中发挥了重要作用,其启动、促迁移或诱导作用主要依赖于有功能的Ras和ERK1/2的激活,并与EGFR酪氨酸激酶信号途径紧密相关。EGFR是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的细胞表面受体,与配体结合后,可自发磷酸化配体,活化各种信号路径的下游蛋白,包括有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等。Ras-Raf-MEK-ERK通路是MAPK级联信号通路之一,是介导细胞外信号从细胞表面传导至细胞内部的重要信号传递途径,即细胞受到刺激后,需通过一系列级联反应,引起特定蛋白的表达或活性改变,才能产生特定的生物学反应,诱导细胞的移行、增殖或分化。可以看出,TFF1-MUC5AC-EGFR及MEK/ERK目关通路与胃粘膜屏障保护、修复功能关系密切。补中益气汤是金元一代名医李东垣根据“内伤脾胃,百病由生”的学术思想而创制的代表方剂,主要由黄芪、人参、白术、甘草、升麻、柴胡、当归、陈皮等药味组成,全方功在补中益气,升阳举陷,是临床用于脾虚证治疗的经典方。脾虚证是中医临床常见的证候之一,在胃肠道粘膜疾病如消化性溃疡、慢性胃炎等中脾虚证患者占有一定比重,在各种亚健康人群当中更为多见。脾虚是以消化系统形态与功能异常为特征的多系统多功能异常的综合,胃肠粘膜的病变与其相应的功能障碍可能是脾虚证的病理基础之一。已有研究发现,脾虚大鼠胃粘膜组织确有损伤,这为“脾胃内伤,百病由生”提供了现代医学的组织形态学依据。脾为后天之本,为气血生化之源,“四季脾旺不受邪”,这说明脾胃与人体防御功能密切相关。脾失健运,不能运化水谷精微,必然会导致机体防御抵抗机能的下降,导致各种疾证的出现,这提示机体处于脾虚状态时,其胃肠粘膜本身防御功能是下降的,因而易出现各种病症。目前对补中益气汤的研究多见于临床疗效的观察,基础研究较薄弱,并多以药效学研究为主。补中益气汤对脾虚大鼠胃粘膜易损伤性有复健作用,但其机制缺乏深入探讨。因此,观察补中益气汤对胃粘膜的保护作用,并从TFF1-MUC5AC-EGRFR及MEK/ERK相关通路等角度探讨其可能机制,不仅有助于脾虚证本质的现代阐释,而且有望揭示补脾方剂药理作用的分子机制。二方法与结果1.补中益气汤对脾虚大鼠胃粘膜TFF1mRNA与蛋白表达的影响TFF1是由胃粘膜上皮细胞分泌的一种小分子多肽,为三叶因子家庭成员之一,在胃粘膜的屏障保护及损伤修复中发挥重要作用。目的：本实验观察脾虚大鼠胃粘膜TFF1mRNA与蛋白表达变化及补中益气汤对其的影响,并探讨相关作用机制。方法：SD大鼠称重随机分组,分为空白对照组、脾虚损伤组、补中益气汤组、非脾虚损伤组。脾虚损伤组、补中益气汤组大鼠给予100%大黄水煎剂灌胃造成脾虚,一天2次,连续10天,其余两组灌服等体积蒸馏水。第11天开始,补中益气汤组给予补中益气汤灌胃治疗7天,其余三组灌服等体积蒸馏水。第18天(术前禁食24h),除空白对照组外的另外三组灌服消炎痛溶液造成胃粘膜损伤。7h后处死大鼠取出胃,取出胃,冰上刮取胃粘膜,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR法)检测TFF1mRNA,用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测TFF1蛋白表达的变化。结果：与非脾虚损伤组比较,脾虚损伤组大鼠胃粘膜TFF1mRNA与蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01)；与脾虚损伤组比较,补中益气汤组大鼠胃粘膜TFF1mRNA、蛋白明显上调(P<0.05)。结论：脾虚损伤组大鼠胃粘膜TFF1mRNA与蛋白表达显著下降,这提示脾虚大鼠胃粘膜防御能力减弱,经补中益气汤治疗后两者表达明显增加,提示该方通过提高TFF1的表达来增强胃粘膜防御能力,促进受损胃粘膜细胞的重建和修复,这可能是补中益气汤降低胃粘膜易损性的机理之一。2.补中益气汤对脾虚大鼠胃粘膜MUC5ACmRNA与蛋白表达的影响胃粘液保护层是胃粘膜的重要防御体系,其主要成分为高分子量的粘蛋白。粘蛋白是一组高度糖基化的不同糖蛋白的总称,广泛存在于消化道,是维持粘液层厚度及胶体形态的主要成分,在胃粘膜的防御和修复过程中扮演着重要的角色。分泌型MUC5AC是胃肠道凝胶主要成分之一,生理状态下与TFF1配对结合,促使胃肠粘膜更好发挥防御保护作用。目的：本实验在前期研究基础上,进一步观察脾虚大鼠胃粘膜MUC5ACmRNA与蛋白表达的变化及补中益气汤对其的影响,探讨相关作用机制。动物分组、造模、治疗、消炎痛处理、取材、检测方法同实验一。结果：与非脾虚损伤组比较,脾虚损伤组大鼠胃粘膜MUC5ACmRNA与蛋白表达有一定下调,但无统计学意义；与脾虚损伤组比较,补中益气汤组大鼠胃粘膜MUC5AC蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论：脾虚损伤组大鼠胃粘膜MUC5AC蛋白表达下调,提示脾虚时胃粘液凝胶层防御能力下降,补中益气汤可提高MUC5AC蛋白的表达,促进胃粘液凝胶的形成,同时与TFF1发挥协同增效作用,这可能是补中益气汤保护胃粘膜机制之一。3.补中益气汤对脾虚大鼠胃粘膜EGFR蛋白表达的影响EGFR是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的细胞表面受体,其被配体激活后启动胞内信号传导,经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应,调节转录因子,激活基因的转录,指导细胞迁移、黏附、增殖、分化或凋亡。目的：本实验在前期实验基础上进一步观察脾虚大鼠胃粘膜EGFR蛋白表达变化及补中益气汤对其的影响,并探讨相关机制。动物分组、造模、治疗及消炎痛处理同实验一。消炎痛灌胃7h后处死大鼠,取出胃,沿胃大弯剪开,用0.9%NaCL冲洗干净胃粘膜,选取胃粘膜病变相同部位剪取小块,放入10%中性福尔马林缓冲溶液中固定,采用免疫组化法(immunohistochemistry, IHC)检测EGFR蛋白表达的变化。结果：与非脾虚损伤组比较,脾虚损伤组大鼠胃粘膜EGFR蛋白表达明显下调,(P<0.01)；与脾虚损伤组比较,补中益气汤组大鼠胃粘膜EGFR蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论：补中益气汤可提高EGFR蛋白表达,促进受损粘膜的重建修复,并可能激活下游信号传导通路,这可能是该方对脾虚大鼠胃粘膜易损性复健作用的机制之一。4.补中益气汤对脾虚大鼠胃粘膜MEK、ERKmRNA与蛋白表达的影响丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)介导的细胞信号传导系统是一条重要信号转导通路,广泛存在于真核细胞内。细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)是MAPK家族成员中最早得到证实的转导途径。各种生长因子或其他刺激因素等细胞外信号能促使ERK通路的激活,引起特定蛋白的表达或活性改变,最终影响细胞代谢功能。目的：本实验在前期研究基础之上,进一步观察脾虚大鼠MEK、ERKmRNA与蛋白表达变化及补中益气汤对其表达的影响,深入探讨相关机制。动物分组、造模、治疗、消炎痛处理、取材同前实验一。采用荧光定量PCR(FQ-PCR法,SYBR Green I)检测MEK、ERKmRNA,用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测MEK、ERK蛋白表达的变化。结果：与非脾虚损伤组比较,脾虚损伤组大鼠胃粘膜MEKmRNA与蛋白表达明显下降(P<0.01)；与脾虚损伤组比较,补中益气汤组大鼠胃粘膜MEKmRNA与蛋白表达明显上调(P<0.05),胃粘膜ERKmRNA与蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01))。结论：补中益气汤可通过上调TFF1、EGFR的表达来激活MEK/ERK信号传导途径,从而促进细胞迁移、增殖或分化,这可能是该方胃粘膜保护及促进胃粘膜修复重建的深层次作用机制之一。三结论TFFl对胃肠粘膜有重要的保护作用,并可促进受损胃粘膜的重建修复,其机制涉及到TFF1与其对应粘蛋白MUC5AC的相互作用,促进胃粘液凝胶层的形成,并通过提高EGFR的表达进一步激活下级MEK/ERK信号传导通路,从而调节细胞代谢,促进细胞的移行、增殖、分化等。从TFF1-MUC5AC-EGFR及MEK/ERK信号传导途径等角度深入研究脾虚状态下胃粘膜防御功能及补中益气汤相关作用机制,对阐释脾虚证的病理机制及健脾方药的治疗机理有重要的理论意义。本实验研究结果表明：①补中益气汤能提高脾虚大鼠胃粘膜TFF1mRNA与蛋白的表达；②补中益气汤可提高脾虚大鼠胃粘膜MUC5AC蛋白的表达；③补中益气汤可提高脾虚大鼠胃粘膜EGFR蛋白表达；④补中益气汤可上调脾虚大鼠胃粘膜MEKmRNA与蛋白及ERKmRNA与蛋白的表达水平。综合研究结果分析,脾虚大鼠经消炎痛攻击后胃粘膜TFF1mRNA与蛋白、MUC5AC蛋白、EGFR蛋白、MEKmRNA与蛋白、ERKmRNA与蛋白表达显著下降,提示脾虚时机体胃粘膜防御功能下降,并处于高应激状态,对各种攻击因素反应敏感。经过补中益气汤治疗后,它们的表达有显著的上调,提示该方可通过提高TFF1、MUC5AC的表达,加强二者间的相互作用,增强胃粘膜的屏障保护作用。同时可增加EGFR表达,协同TFF1,激活下游MEK/ERK信号转导通路,刺激胃粘膜上皮细胞移行、增殖、分化,加速受损胃粘膜细胞的重建和修复,这可能是补中益气汤保护胃粘膜,降低脾虚胃粘膜易损性的作用靶标,这在一定程度上也体现了中医药多靶点,多层次的作用特点。