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琥珀酸作为典型的四碳平台化合物,被美国能源部列为最有潜力的十二种生物基大宗化学品之首。微生物法制备琥珀酸因其具有绿色、能耗低的特点比化学法更具竞争力。琥珀酸的代谢过程需要大量基因与酶参入其中,CO2的固定与乙醛酸支路的代谢水平与琥珀酸的产量密切相关,这些基因与酶的适度表达对琥珀酸的生产尤为重要。本文首先通过全局转录因子Cra的定向进化,对代谢过程的基因与酶的表达进行调控,获得琥珀酸产量明显提高的突变菌株;然后对琥珀酸代谢过程的关键基因表达水平及关键酶酶活进行测定证明突变菌株通过增强CO2的固定与激活乙醛酸支路来提高琥珀酸产量;最后通过对Cra的结构与功能进行分析,发现突变Cra更容易被效应物激活,可以增强CO2固定能力及激活乙醛酸支路。首先,通过定向进化全局转录因子Cra调控碳代谢相关基因与酶的表达以提高琥珀酸产量。使用易错PCR方法对全局转录因子Cra进行突变,连接到表达载体pTrc99A上转化到大肠杆菌AFP111中构建突变菌株库,通过基于96孔板与HPLC的快速筛选对菌株库进行筛选,获得6株高产菌,将6株高产菌的位点进行整合最终筛选出高产菌Tang1541琥珀酸产量达到78.6 g/L与对照菌Tang1533相比产量提高27%,Tang1544琥珀酸产量达到74.4 g/L,与对照菌Tang1533相比产量提高20%。其次,本文通过对琥珀酸代谢过程中关键基因表达水平与关键酶酶活测定发现突变菌株CO2的固定基因ppc,pck相对表达量变化不明显但突变菌株Tang1541,Tang1544的PPC酶活均达到了0.515 U/mg左右与对照组Tang1533的PPC酶活为0.175 U/mg相比提高了2倍。同时,对照组Tang1533的PCK酶活为0.876 U/mg,突变菌株Tang1541,Tang1544的PCK酶活分别为1.214 U/mg,1.143 U/mg,与对照组相比均提高30%以上,表明突变菌株CO2的固定能力显著增强。同时Tang1541乙醛酸支路的基因aceA,aceB的相对表达量上调分别为2.81与2.07倍,Tang1544上调分别为3.16与4.35倍,上调幅度很显著,Tang1541,Tang1544的异柠檬酸裂解酶、苹果酸合酶均分别提高了20%以上,乙醛酸支路的代谢通量显著增强提高了琥珀酸产量。最后,通过ITC实验发现突变Cra的自由结合能分别为-60.263±0.5 KJ/mol,和-69.722±0.8 KJ/mol低于未突变Cra的-41.997 kJ/mol,预示着突变转录因子更容易与FBP进行结合而处于激活状态,而EMSA实验也显示突变Cra因子与aceABK启动子结合能力增强,激活了乙醛酸支路。本文首次在E.coli中通过表达进化的转录因子Cra,实现了E.coli对琥珀酸代谢途径的全局调控;并通过ITC与EMSA实验证实突变的转录因子更容易被激活进而增强CO2固定能力、提高乙醛酸支路通量最终提高琥珀酸产量。研究结果为高产琥珀酸基因工程菌的构建提供了新思路,也对研究代谢途径间调控作用具有一定的借鉴意义。