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转录调控是植物生长发育、逆境反应、信号转导、次生代谢生物合成等一系列基因表达的最主要调控形式,转录因子是参与基因转录水平调控过程的重要因素。bHLH蛋白是植物转录因子家族之一,可以特异的识别结合基因启动子中的bHIH顺式作用元件,调控花色素苷生物合成相关的一系列基因表达。在块根中大量合成花色素苷从而使块根呈紫色的一类甘薯称为紫心甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.],因其富含花色素苷的部位为深埋地下而具有一定的特殊性,其花色素苷的合成和调控模式与其他植物是否存在差异值得研究。针对紫心甘薯在理论研究中具有试材独特性及在开发应用上具有巨大的潜力。为此本文以紫心甘薯作为研究试材,从PobHLH2基因的克隆、IbbHLH2蛋白的亚细胞定位以及IbbHLH2基因的表达特征等方面进行研究,获得的研究结果如下:
1.从紫心甘薯品种“山川紫”中克隆得到了IbbHLH2基因的全长cDNA序列,其长度为2304 bp,包括一段长2004 bp完整的开放阅读框,编码667个氨基酸,并将该基因在GeneBank中进行了登录,其登录号为:JF508437。预测的IbbHLH2蛋白分子量为164.2 kDa,等电点为4.89；其二级结构由45.28％的α-螺旋、38.68％的无规卷曲、11.39％的延伸链,以及4.65％的β-转角所组成。蛋白三级结构的预测结果表明,IbbHLH2蛋白具有bHLH蛋白家族典型的碱性-螺旋-环-螺旋结构域。亚细胞定位预测表明,IbbHLH2蛋白定位于细胞核中。通过氨基酸多重比对和进化树分析表明IbbHLH2是植物bHLH蛋白家族的成员之一。
2.构建了用于IbbHLH2蛋白亚细胞定位分析的pBEGFP+IbbHLH2真核表达载体,并通过农杆菌LBA4404介导转化洋葱表皮细胞,共培养18 h后,在荧光显微镜下观察发现IbbHLH2蛋白定位在细胞核中。
3.通过实时荧光定量PCR对着色特征不同的甘薯块根中IbbHLH2基因的表达特征进行分析,结果发现其表达量与花色素苷含量的变化趋势一致,并且与花色素苷合成途径中关键酶基因IbCHS、IbCHI、IbF3H、IbF3H、IbDFR和IbANS的表达量的变化趋势基本相同。由此推测,IbbHLH2基因能够调控花色素苷合成途径中关键酶基因的表达,进而影紫心甘薯中花色素苷的积累。
4.构建了pCambia1300-221-Myc+IbbHLH2真核超表达载体,并将其转化到农杆菌LBA4404中,为IbbHLH2基因的遗传转化及其功能分析奠定了基础。