未成熟卵体外成熟培养(IVM)是指从不孕患者体内获取未成熟卵子,通过模拟体内卵母细胞的成熟环境,将卵子体外培养至成熟,再通过体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术治疗不孕症的方法。人类IVM的第一次成功分娩至今已有20余年,随着成功妊娠的不断增加,IVM技术在辅助生殖技术领域发展迅速,给卵泡成熟障碍者尤其是多囊卵巢综合征(PCOS)患者带来了福音。然而目前发现卵母细胞虽能在体外成熟、受精、卵裂、胚胎移植后成功妊娠,但仍存在体外成熟率、卵裂率和妊娠率低等问题。在体外培养中,哺乳动物卵母细胞减数分裂的调节受培养介质的影响,为了提高未成熟卵母细胞的体外成熟率和胚胎质量,许多研究尝试在体外培养体系中添加不同物质改善培养微环境以提高卵母细胞体外成熟率和卵母细胞发育潜能。目前寻求最佳的培养体系,改善IVM治疗结局,成为IVM技术的研究热点。在卵母细胞成熟以及早期胚胎发育过程中,线粒体的功能备受关注。线粒体DNA(mt DNA)拷贝数和线粒体代谢活性如何影响卵母细胞成熟、受精和后续胚胎发育潜能仍不清楚。以往的许多研究表明mt DNA拷贝数在卵母细胞成熟和随后的胚胎发育过程中起着至关重要的作用。人们认为卵母细胞的mt DNA拷贝数已成为评价卵母细胞质量的一个重要指标。但有关mt DNA拷贝数对卵母细胞成熟和胚胎发育潜能的影响仍存在不同结论。α亚麻酸(ALA)是全顺式9、12、15十八碳三烯酸,属n-3系列多不饱和脂肪酸(PUFAs)。它是生物膜的重要组成成分之一,在体内可转化为二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)发挥功能。ALA不仅能增加卵母细胞前列腺素E2(PGE2)和环磷酸腺苷(c AMP)的合成,还能通过提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等抗氧化酶的活性,减少脂质过氧化反应和丙二醛(MDA)的生成,在一定程度上促进卵母细胞的成熟。有关ALA对哺乳动物未成熟卵母细胞IVM的研究和对卵母细胞线粒体的影响已有报道,但至今未见ALA对人未成熟卵母细胞体外成熟和胚胎发育影响的研究。我们的前期研究认为,添加成熟卵泡液可提高人未成熟卵母细胞的体外成熟率、受精率和卵裂率,效果优于添加激素组。故在此基础上,本研究探讨ALA对人未成熟卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响。目的本实验观察ALA对人卵母细胞体外成熟及其发育潜能的影响,同时通过测定体外成熟卵母细胞mt DNA拷贝数和培养液中MDA含量和SOD总活力探讨ALA对卵母细胞发育的可能作用机制。材料和方法本实验中未成熟卵母细胞均来自2014年10月~2015年10月于郑州大学第三附属医院生殖中心因男方因素行ICSI助孕的患者,均采用标准长方案促排卵,共收集423名患者的689枚未成熟卵母细胞。第一部分:收集273名患者的未成熟卵母细胞441枚,其中MI期卵母细胞179枚,GV期卵母细胞262枚。将MI和GV按相同的构成比随机分为5组,分别放入含不同浓度(0μM,10μM,50μM,100μM,200μM)ALA培养液中,培养24h后观察卵母细胞成熟情况。根据各组成熟情况用Real-time PCR方法分别对ALA 50μM组和ALA 0μM组成熟卵母细胞线粒体DNA拷贝数进行测定。第二部分:收集150名患者的未成熟卵母细胞248枚,其中MI 87枚,GV 161枚。将MI和GV按相同的构成比随机分为3组进行体外培养,培养系统分别为:(1)50%基础IVM培养液+50μM ALA+50%成熟卵泡液;(2)50%基础IVM培养液+50%成熟卵泡液;(3)基础IVM培养液。依次记为A、B、C组,培养24h后观察卵母细胞成熟情况。对成熟的卵母细胞行ICSI授精,后续观察比较三组未成熟卵母细胞的成熟率、ICSI受精率、2PN卵裂率、可利用胚胎形成率和囊胚形成率等实验室指标。同时测定及比较三组成熟卵母细胞的IVM培养液中MDA含量和SOD总活力。统计学分析数据处理均使用SPSS17.0统计学软件包。以均数±标准差(x±s)或百分率(%)表示不同类型数据,计量资料采用t检验,率的比较采用卡方检验。多组比较满足正态性和方差齐性的采用单因素方差分析,不满足则采用K个独立样本检验或Kruskal-Wallis秩和检验。检验水准α=0.05。多重比较按比较次数k适当调整显著性水平,α’=0.05/k,两两比较采用Bonferroni法,以P<α’为差异有统计学意义。结果第一部分(1)不同浓度(0μM,10μM,50μM,100μM,200μM)ALA体外培养未成熟卵母细胞,总24h成熟率以ALA 50μM组(70.1%)最高,明显高于ALA0μM组(42.1%)及ALA 200μM组(34.1%),差异均有统计学意义(P<0.005);(2)不同浓度(0μM,10μM,50μM,100μM,200μM)ALA体外培养MI期卵母细胞,24h成熟率两两比较差异均无统计学意义(P>0.005)(3)不同浓度(0μM,10μM,50μM,100μM,200μM)ALA体外培养GV期卵母细胞,24h成熟率以ALA 50μM组(64.4%)最高,明显高于ALA 0μM组(28.9%)及ALA 200μM组(18.2%),差异均有统计学意义(P<0.005);(4)ALA50μM组成熟卵母细胞mt DNA拷贝数(3.64×107±1.85×106)大于ALA0μM组(3.42×106±1.95×105),差异有显著统计学意义(P<0.01)。第二部分(1)50μM ALA+成熟卵泡液组(A组)、成熟卵泡液组(B组)、对照组(C组)总24h成熟率依次为75.9%、57.3%、38.0%,A组高于B组且B组高于C组,差异均有统计学意义(P<0.016);(2)三组中MI期卵母细胞24h成熟率分别为83.9%、78.6%、53.6%,A组成熟率高于C组,差异有统计学意义(P<0.016);A组成熟率高于B组,差异无统计学意义(P>0.016);三组中GV期卵母细胞24h成熟率分别为71.4%、46.3%、29.4%,A组成熟率高于B组、C组,差异均有统计学意义(P<0.016);(3)三组卵母细胞ICSI后的受精率,两两相比差异无统计学意义(P>0.016);三组卵母细胞2PN卵裂率依次为92.3%、88.6%、57.9%,A、B组2PN卵裂率较C组高,差异有统计学意义(P<0.016);三组可利用胚胎率,两两相比差异无统计学意义(P>0.016);囊胚形成率依次为22.9%、16.1%、9.1%,两两相比差异均无统计学意义(P>0.016),但较对照组出现逐渐增高的趋势。(4)A组MDA含量低于B组及C组,差异均有统计学意义(P<0.016);三组间SOD总活力,两两相比差异无统计学意义(P>0.016)。结论1.ALA有利于人未成熟卵母细胞的体外成熟,浓度以50μM最佳,且对GV期卵母细胞的成熟作用比对MI期卵母细胞作用更明显。2.ALA可能通过增加卵母细胞mt DNA拷贝数和降低氧化应激反应提高卵母细胞的发育潜能。