Bacillus amyloliquefaciens M1菌株生产的抗菌脂肽对耐药性海洋病原弧菌抑菌活性的研究

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解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在其生长过程中能产生多种脂肽类物质,具有显著的抗细菌、抗真菌和抗支原体活性。抗菌脂肽是由脂肪酸链和肽链两部分构成,兼具亲水性和疏水性,这类物质种类多样,结构各异。抗菌脂肽在农业生物防治、医药和环境治理等多个领域内具有巨大的应用潜力。抗菌脂肽具有广泛的抑菌活性,但是否对海洋病原弧菌有抑制作用呢?海洋动物弧菌病会对海水养殖造成重大的经济损失。目前主要通过使用抗生素来防治海洋动物弧菌性疾病,但抗生素容易使海洋环境中的微生物产生耐药性,破坏海洋菌群的平衡。所以亟需寻找一种能杀死耐药性病原弧菌的,天然且安全的抑菌物质来防治海洋动物的弧菌性疾病。本研究中,M1菌株是一株分离自红树林的菌株,其次级代谢产物具有较强的抑菌活性。利用常规方法和分子生物学方法对M1菌株进行鉴定,该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens),这是一株在实际应用中比较安全的细菌。M1菌株可以对9种常见的具有耐药性的海洋病原弧菌产生抑菌活力。为了降低M1菌株产抑菌物质的生产成本,利用廉价原料优化了发酵培养基。最佳发酵条件为:豆饼粉1.0%(w/v),面粉1.5%(w/v),pH7.0,培养温度为28℃,180rpm振荡培养24h。完成了M1菌株在10-L发酵罐中的发酵实验,M1菌株在发酵培养21h时进入生长稳定期,菌体量达到1.6×109cells/mL,在第18h时抑菌活力最大,抑菌圈直径为34.0mm、并测定了淀粉酶活力(最高为48.7U/mL)和蛋白酶活力(最高为2.3U/mL)随时间变化规律。通过酸沉淀、甲醇抽提,薄层层析和高效液相色谱法(HPLC)等手段对发酵上清液中的抑菌物质进行了分离和纯化,获得了抑菌物质NQ。质谱分析表明,抑菌物质NQ是表面活性素(surfactin),由Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu分别连接C12、C13、C14和C15的β-羟基脂肪酸构成的环状脂肽。纯化后的抗菌脂肽NQ最适作用温度是28℃,在20℃-40℃之间都有良好的稳定性;在pH7.0-9.0之间抗菌脂肽的稳定性较好,其最小抑菌浓度为12.5μg/mL。对M1菌株纯化后的抗菌脂肽的抑菌机理进行初步探究:纯化后的抗菌脂肽不仅可以杀死完整的鳗弧菌细胞,还能杀死鳗弧菌细胞的原生质体,这说明抗菌脂肽可能是通过破坏细胞膜来杀死细菌的。电镜检测发现,被抗菌脂肽作用过的鳗弧菌细胞表面出现破损,细胞出现降解,细胞内容物释放,导致细胞死亡,说明抗菌脂肽能破坏鳗弧菌细胞表面结构。荧光检测发现抗菌脂肽作用过的鳗弧菌细胞可以被染料PI染色,进一步证明抗菌脂肽能破坏细胞膜结构,改变细胞通透性,破坏细胞的完整性,进而杀死整个细胞。
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