随着能源、资源与环境危机的加剧,生物能源和资源的开发已逐渐成为现在生物化工的两大研究热点。酶介导的生物转化因其高效、高选择性及条件温和等优点而成为关键技术。非甾体类抗炎药(S)-萘普生因其广泛的用途和较大的市场需求长期受到关注。而新一代生物能源异丁醇则因其高能量密度、低蒸汽压、低吸水性等优于生物乙醇的特点而越来越受到重视。本文依托实验室精确、可靠的液相色谱分析技术、高通量筛选定向进化技术平台以及先进的X射线衍射技术,针对手性药物的酶法拆分工艺及生物能源异丁醇生产途径中关键酶的结构和分子改造进行了深入研究。论文内容涉及酶的克隆、表达、分子改造、发酵、纯化、表征和结晶,以及生物加工产品的分离和提纯,主要工作包括三个部分：(1)酯酶的克隆、表达及其在(S)-萘普生酶法制备中的应用；(2)醇脱氢酶的定向进化以提高异丁醇生产率；(3)上述醇脱氢酶及其突变体的晶体结构与结构解析。第一部分,以酶促水解拆分(R,S)-萘普生甲酯制备光学纯(S)-萘普生为目标,从实验室专利菌种Bacillus subtil is ECU0554中克隆出一个高对映选择性(对映体过量值ee>98%)催化萘普生甲酯水解生成(S-)萘普生的羧酯酶BsE-NPO1,并将其在Escherichia coliBL21中进行过量表达。结果表明,BsE-NPO1是一个典型的羧酯酶,分子量约32kDa,最佳反应条件为50℃和pH8.5。通过高速机械碾磨的方法增加底物的分散,可提高水解反应的效率,从而避免添加乳化剂吐温-80。通过剩余底物(R)-萘普生甲酯的消旋化,可以回收利用无效的对映体,从而提高了(S)-萘普生的总得率。利用自行发酵的羧酯酶BsE-NPO1,进行了2升体积的(S)-萘普生的重复批式制备。经过10批重复制备反应后,得到了百克级光学纯度大于99%ee值的(S)-萘普生。以消旋萘普生甲酯为基准计算,总分离得率平均值达85%。第二部分,以开发高效的NADH-依赖的异丁醇生产途径为宗旨,通过定向进化的方法,提高代谢途径中的最后一步酶反应_醇脱氢酶催化异丁醛还原生成异丁醇的催化效率。首先选择来源于Lactococcus lactis的NADH-依赖的醇脱氢酶L1AdhA为定向进化的起点,通过一轮随机突变并对其突变点进行组合突变后,得到一个含有三个氨基酸突变(Y50F、1212T和L264V)的突变体L1AdhARE1,其结合常数(KM值)降低为野生酶的1/7,催化效率(kcat/KM值)提高了30倍。然后在野生酶L1AdhA和突变体L1AdhARE1蛋白结构的基础上,对位于蛋白活性位点附近的氨基酸残基进行定点饱和突变,得到一个含有四个氨基酸突变(Y50F、N110S、1212T和L264V)的突变体L1AdhA29C8。突变体L1AdhA29C8催化异丁醛的KM值降低为野生酶的1/17,催化效率提高了160倍。第三部分,为了揭示突变酶异丁醛活力提高的结构基础,通过X射线衍射与分子置换,确定了野生酶L1AdhA及其含有三个氨基酸突变的突变体L1AdhARE1的晶体结构,分辨率分别为1.9A和2.5A。将野生酶L1AdhA和突变体L1AdhARE1的晶体结构比对后发现,突变体L1AdhARE1与野生酶L1AdhA除了三个氨基酸(Y50F、1212T和L264V)的差异外并没有显示出较大范围的结构变化。突变体L1AdhA相对于野生酶L1AdhA还原异丁醛活力的大幅度提高主要归功于突变点Y50F和L264V所导致的底物结合口袋的增大和疏水性的增加,以及底物进入活性中心通道的扩大,从而有助于提高酶对体积较大的非天然底物异丁醛的催化活性。