论文部分内容阅读
目的:通过生物信息学预测和临床样本分析,验证MOV10是否是影响胶质瘤发生发展的危险因素,同时在细胞水平上研究MOV10是否通过调控lncRNA DLEU1的表达水平,影响胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡和自噬过程。方法:1.生物信息学分析MOV10在泛癌和胶质瘤中的表达水平及患者预后,并通过临床组织样本和胶质瘤细胞进行验证。（1）分析MOV10在TCGA数据中泛癌的表达水平。（2）通过TCGA、CGGA和GEO数据库分析MOV10在胶质瘤中的表达情况。（3）将MOV10表达水平分别与肿瘤病理分级、IDH突变、1p/19q染色体共缺失进行差异分析。（4）根据MOV10表达中位值,绘制胶质瘤患者生存曲线。（5）将MOV10表达水平分别与胶质瘤患者的临床因素进行生存分析。（6）检测MOV10在胶质瘤和正常脑外伤组织中的表达水平。（7）检测MOV10在人脑星型胶质正常细胞和胶质瘤细胞中的表达水平。2.明确MOV10对胶质瘤细胞生物学功能的影响。（1）利用RT-q PCR和Western blot确定MOV10 si RNA的干扰效率。（2）沉默MOV10后,通过MTS、克隆形成、划痕、Transwell、流式细胞术测凋亡和Western blot检测相关标志蛋白,评估MOV10对胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。（3）生物信息学分析MOV10和自噬的相关性;沉默MOV10后,评估胶质瘤细胞自噬水平。3.明确MOV10结合并调控lncRNA DLEU1。（1）通过生物信息学预测,找到MOV10相互作用的lncRNA。（2）利用RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验,验证MOV10和lncRNA DLEU1的结合关系。（3）构建MOV10稳定低表达的胶质瘤细胞株,并过表达lncRNA DLEU1,通过RT-q PCR鉴定基因表达效率和确定MOV10对lncRNA DLEU1的调控作用。4.明确MOV10通过调控lncRNA DLEU1对胶质瘤细胞生物学功能的影响。（1）细胞分别转染慢病毒后,通过MTS、克隆形成、划痕、Transwell、流式细胞术测凋亡和Western blot检测相关标志蛋白,评估胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力和凋亡水平的变化。（2）利用m RFP-GFP-LC3腺病毒评估自噬通量并检测LC3和P62蛋白,评估胶质瘤细胞自噬水平的变化。结果:1.泛癌分析发现,MOV10在19肿瘤中高表达,其中包括胶质瘤。在TCGA、CGGA和GSE21354数据中,MOV10在胶质瘤组织中的表达水平均显著高于对应的正常或癌旁组织。MOV10的表达水平在IDH野生组、1p/19q未缺失组更高,并随着胶质瘤病理分级的增高而升高,并且MOV10表达水平越高,患者的生存时间越短、预后越差。对比正常脑组织,MOV10在胶质瘤组织中明显上调,与人脑星形胶质正常细胞相比,MOV10在胶质瘤细胞中显著高表达。2.转染MOV10 si RNA后,MOV10的m RNA和蛋白表达显著下调。MTS、克隆形成、划痕、Transwell和流式细胞术结果表明,沉默MOV10后,胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显下降,凋亡水平升高,并且CDK6、Cyclin D1、N-Cadherin、MMP-2、Bcl-2蛋白表达水平显著降低,Bax表达水平升高。通过生物信息学分析,发现MOV10和LC3、P62显著相关,并且沉默MOV10后自噬水平升高,P62蛋白下调,LC3II/LC3I比值升高。3.通过生物信息学预测,发现MOV10和lncRNA DLEU1相互作用并得到了两者的结合位点。RIP实验显示MOV10和lncRNA DLEU1相互结合。RT-q PCR结果显示,低表达MOV10胶质瘤细胞株构建成功,沉默MOV10会下调lncRNA DLEU1表达水平,lnc DLEU1病毒过表达效率较高。4.克隆形成、MTS、划痕和Transwell实验结果显示,沉默MOV10后,胶质瘤细胞的增殖活力、迁移和侵袭能力明显降低,但过表达lncRNA DLEU1能改善这些效应。流式结果表明,过表达lncRNA DLEU1可以抑制胶质瘤细胞凋亡。Western Blot结果表明,沉默MOV10使CDK6、Cyclin D1、N-cadherin、MMP-2和Bcl-2蛋白表达下降,Bax表达升高,过表达lnc DLEU1可以抑制上述蛋白的变化。MOV10低表达慢病毒转染后,胶质瘤细胞P62蛋白下调、LC3II/LC3I比值升高、自噬通量升高,但是lnc DLEU1过表达转染后,这些效应均不能被逆转。结论:本研究证实了MOV10在胶质瘤患者中高表达,其高表达伴随着患者不良预后,沉默MOV10可以促进胶质瘤细胞自噬,并且MOV10可以通过调控lncRNA DLEU1影响胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡等生物学功能。