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第一部分多巴反应性肌张力障碍家系GCH1、TH、parkin基因突变研究背景与目的多巴反应性肌张力障碍(dopa-responsive dystonia, DRD)是一种遗传性肌张力障碍病,发病率约1/200万。具有症状波动性及左旋多巴治疗效果好的特点。DRD属于可以治疗的疾病,因此对DRD患者的早期确诊意义重大。但是DRD患者的临床症状十分复杂,儿童患者症状可以表现为类似典型脑瘫样肌张力障碍,成年患者的症状可以仅表现为帕金森病,导致临床上早期确诊DRD十分困难,许多患者都被误诊。通过对DRD家系基因突变检测能帮助我们明确患者基因突变情况,深入地了解DRD临床表型多样性的遗传学基础。DRD的致病基因为GCH1基因与TH基因,临床上有时较难鉴别DRD与常染色体隐性遗传青少年型帕金森病(autosomal recessive juvenile parkinson,ARJP ),ARJP的致病基因为parkin基因。当DRD患者基因突变检测中未发现GCH1基因与TH基因突变时,有必要对患者进一步行parkin基因突变检测。因此对DRD全面的基因突变检测包括了GCH1、TH、parkin三个基因的检测。本研究拟对中国汉族人群10个DRD家系进行GCH1、TH、parkin三个基因检测,并在基因突变检测的基础上对DRD临床特点进行分析,旨在全面了解中国DRD家系基因突变特点与临床特点,了解DRD临床表型与基因型的关系。方法1、研究对象为我院收集10个中国汉族人群DRD家系,包括14名病人,28名家属。2、对10名DRD家系先证者进行GCH1基因突变检测:通过测序的方法对GCH1基因6个外显子及5’非翻译区进行突变检测,实时荧光定量PCR对6个外显子拷贝数进行分析。发现新的基因变异后,通过PCR-RFLP、位点特异PCR、测序等方法在200个正常人上检测基因变异以排除基因多态。证实为基因突变后在家系成员中检测该突变位点。3、采用测序与荧光定量PCR的方法对10个DRD家系先证者TH基因的全长13个外显子进行突变检测。发现新的基因变异后在200个正常人上检测以排除基因多态。证实为基因突变后在进一步家系成员中检测该突变位点。4、对于未检测出GCH1、TH基因突变的家系先证者,进行parkin基因突变检测,通过测序及实时荧光定量PCR方法对parkin基因12个外显子进行突变检测。5、结合基因检测的结果对各个家系临床特点进行分析。结果1、在7个DRD家系先证者上检测出GCH1基因的4个新突变Leu91Val, Pro95Leu, Val204Gly、628delC,1个已报道的突变Gln48Term。在7个家系成员中发现9个无临床症状的基因突变携带者。2、在1个无GCH1基因突变DRD家系先证者上检测出TH基因的复合杂合突变Arg202His与Gly216Ser,其中Arg202His为已报道的突变,而Gly216Ser为新突变。3、在1个未发现GCH1、TH基因突变家系的先证者上检测出parkin基因复合杂合突变Cys253Phe与Gly284Arg,其中Gly284Arg为已报道的突变,而Cys253Phe为新突变。4、临床分析表明中国DRD家系具有症状具有波动性、少量美多巴疗效好的特点。在AD-DRD家系中存在女性患者发病年龄比男性患者大的现象。结论1、本研究在10个中国人群DRD家系中发现6个新突变,进一步拓宽了GCH1、TH、parkin基因突变谱。2、对DRD家系常规进行GCH1 TH parkin三种基因检测能够准确全面地分析DRD遗传方式、基因突变与临床特点,指导临床用药。3、本研究提出了对DRD进行GCH1、TH、parkin三种基因检测的流程。第二部分GCH1基因突变对蛋白功能的影响背景与目的GCH1蛋白(GTP-cyclohydrolase 1,GCH1)既是三磷酸鸟苷酸(GTP)合成四氢生物喋呤(BH4)的起始酶,也是它的限速酶。BH4是芳香族氨基酸羟化酶如苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶的重要辅助因子,当GCH1基因突变引起GCH1蛋白功能改变可引起多巴胺神经递质异常导致多巴反应性肌张力障碍。不同的GCH1基因突变引起蛋白功能改变的机制可能不尽相同。本实验室在前期研究发现中国DRD患者GCH1基因存在Leu91Val、Val204Gly、628delC新突变,携带有新突变家系的临床表现各异,但是新突变引起蛋白的功能改变及临床表型差异的机制仍不明确。本研究针对GCH1基因新突变建立真核细胞瞬时表达GCH1蛋白模型,通过比较野生型与各个突变型GCH1蛋白表达量及与酶活性上的差异,进一步揭示GCH1基因突变致病并引起临床表型差异的分子机制。方法1、通过限制性酶切技术、定点诱变技术构建野生型与3种突变型真核表达质粒GCH1cDNA/pCMV/myc,通过测序验证目的基因及诱变位点是否序列正确。2、通过脂质体2000瞬时转染技术将突变型与野生型质粒分别转染与共转染真核Hela真核细胞,建立真核细胞瞬时表达GCH1蛋白细胞模型。3、通过western blot技术对野生型与突变型蛋白的进行半定量检测,分析瞬时转染真核细胞模型表达野生型、突变型GCH1蛋白的差异。4、进一步通过高效液相色谱分析技术对细胞蛋白酶活性进行检测,分析基因突变对蛋白酶活性的影响。结果1、成功构建了野生型及Leu91Val、Val204Gly、628delC 3种突变型GCH1cDNA/pCMV/myc真核表达质粒,测序验证目的基因序列正确。2、成功构建真核细胞瞬时表达GCH1蛋白的细胞模型,Wester Blot验证可以表达出野生与Leu91Val、Val204Gly、628delC突变的GCH1蛋白。3、Western Blot半定量分析表明单转染与共转染时Hela细胞模型表达野生型及3种突变型蛋白表达无差异。4、高效液相色谱分析技术对Hela细胞表达GCH1蛋白酶活性进行检测表明:同野生型GCH1蛋白相比,3种突变蛋白活性都有下降,并且Leu91Val与Val204Gly蛋白活性下降程度相近,628delC蛋白活性下降最多。结论1、本研究成功构建了多个DRD细胞模型,为DRD蛋白功能及发病机制研究提供了很好的工具。2、Western Blot半定量分析表明,单转染与共转染Hela细胞模型时野生型及3种突变型蛋白表达量无差异,GCH1基因的Leu91Val, Val204Gly、628delC突变可能不是通过引起GCH1蛋白表达的下降致病。3、高效液相色谱分析技术对Hela细胞表达GCH1蛋白酶活性进行检测表明:GCH1基因的Leu91Val, Val204Gly、628delC突变导致GCH1蛋白活性下降,并且由于GCH1蛋白活性下降的程度不同,可能导致了临床表型上差异。