目的:随着癌症的发病率逐渐增高,人类的健康受到严重的威胁,其中结肠癌发病率世界第三,有临床数据表明,结直肠癌患者五年生存率小于10%,因此结肠癌的防治逐渐引起了人们的高度重视。在临床上早期的结肠癌患者可以通过外科治疗根治。但是由于早期结肠癌不易被发现,以及缺少对早期筛查的重视,大多数患者发现时已是晚期。晚期转移性结肠癌的恶性程度较高,进展速度较快,因此对于晚期患者,治疗的主要目标是如何提高生活质量以及延长生存期。随着社会及科学的发展,我们进入到靶向精准治疗的时代,靶向药物的出现对晚期结肠癌患者起到了重要的作用。BRAF是MAPK通路中RAS下游的核心分子,参与并调控细胞内信号转导及在肿瘤生长、发展、预后等方面发挥重要作用。不同肿瘤的BRAF基因突变率不同,约8%恶性肿瘤患者发生BRAF突变,其中恶性黑色素瘤BRAF突变率约为50%,甲状腺癌为30%-70%,肠癌为8%-10%,非小细胞肺癌为0.5%-4.9%,而BRAF绝大部分突变形式为BRAFV600E突变。维罗非尼(RG7204,PLX4032)是一种靶向BRAFV600E的小分子抑制剂,可以通过抑制BRAFV600E,有效阻断MAPK通路,进而抑制肿瘤细胞的增殖。在BRAF600E突变的恶性黑色素瘤中反应率为50%,而在BRAFV600E突变的结直肠癌中的反应率仅为5%。维罗非尼治疗的恶性黑色素瘤患者在有效率以及总生存率上都有明显的提高,而在临床治疗效果上也已经超越了化疗。而由于肠癌基因型复杂多样,因此对于维罗非尼的反应性较差,因此在肠癌中的治疗中会联合其他靶向药或者化疗药来增敏维罗非尼,达到协同治疗作用。但无论是恶性黑色素瘤还是结直肠癌,随着治疗的进行,都会对维罗非尼产生原发性或获得性的耐药,从而极大的限制了临床上对维罗非尼的应用。即使同一肿瘤组织也可能存在着不同的基因表达水平,而临床上很难对整个肿瘤组织进行检测,因此肿瘤组织中存在着原发性的耐药细胞。与此同时,在维罗非尼单药或联合的治疗过程中,敏感的肿瘤细胞被逐渐清除,选择性的保留了原发性耐药细胞。另一方面,在药物的持续刺激下,敏感细胞也可以发生突变,从而产生耐药性。有研究报道,肿瘤细胞cyclin D1过表达是维罗非尼原发性耐药的机制之一。在肠癌细胞获得性耐药机制的研究中,目前主要认为EGFR反馈性的激活,导致MAPK通路的持续激活,甚至活化PI3K-AKT-mTOR信号通路,从而促进肿瘤细胞的生长、增殖。与EGFR途径一样,其他受体酪氨酸激酶(RTKs)如肝细胞生长因子受体MET也参与了对BRAF抑制剂的耐药性。针对各种耐药机制,目前临床上已经开始联合用药来增强维罗非尼的有效率,例如BRAF抑制剂联合MEK抑制剂的双靶向抑制MAPK通路激活,可以有效的抑制肿瘤的生长。BRAF抑制剂联合抗EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗可以有效的防止EGFR的反馈激活,达到协同治疗的目的。而最新的研究发现,BRAF抑制剂单药的耐药机制和联合用药的耐药机制是不同的。但是无论哪种治疗,都无法达到完全的反应率,因此我们可以推测,肿瘤细胞耐药机制存在着错综复杂的网络,既单独发挥各自的作用,又可能在各个通路中存在串话,互相影响,而不仅仅是单一的机制。因此,尽可能多的掌握肠癌细胞维罗非尼耐药机制,对于我们进一步增加维罗非尼反应率,提高疗效起到至关重要的作用。STAT3是信号转导及转录激活(Signal transducers and activators of transcription)家族的一员。STAT3在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。有研究证实,STAT3活化可以上调抗凋亡蛋白(BCL-Xl、BCL-2、MCL-1、Survivin)的表达,而当敲除STAT3时,抗凋亡蛋白表达降低,并且可以激活凋亡通路中的凋亡分子Bax,从而诱导细胞凋亡。此外,STAT3作为转录因子还可以调控细胞周期分子(Cyclin D1,、c-myc),促进其转录,从而影响细胞周期的进展。有研究表明STAT3调节PD-L1的表达,有助于抑制免疫,促进肿瘤的发生、侵袭及转移。有研究发现,在部分恶性黑色素瘤中,BRAF抑制剂可以导致STAT3的活化,因此,细胞耐药性的产生可能与STAT3的活化相关。寻找继发性耐药细胞的靶点是解决维罗非尼耐药的重要手段,而对于筛选维罗非尼优势治疗人群,提高药物疗效同样至关重要。研究证实,不同结肠癌细胞对维罗非尼的药物敏感性不同,这种差异可能与肿瘤细胞的异质性,基因表达不同,甚至左右半来源不同相关。因此,筛选出敏感细胞,优势人群,在维罗非尼治疗中及其重要。因此,进一步探究维罗非尼的耐药机制,不仅可以对于靶向联合治疗提供有效的帮助,也可以帮助临床筛选出优势患者。本研究通过细胞实验证实BRAFV600E突变结肠癌细胞对维罗非尼的敏感性是不同的。对维罗非尼激活信号分子导致耐药进行了深入的探究,明确导致激活的原因,以及下游调控的靶分子。并通过加入抑制剂证实了,可以明显增敏维罗非尼对结肠癌细胞的抑制作用,研究结果为明确维罗非尼的继发性耐药提供了理论依据,并可以在后续临床治疗中帮助我们筛选优势患者。材料与方法:1.主要试剂和仪器1.1主要试剂维罗非尼(美国Selleck公司)Stattic(美国Selleck公司)RPMI1640(美国Gibco公司)胎牛血清(美国Gibco公司)STAT3、磷酸化STAT3、PARP、PUMA、BIM、Caspase3、Akt、磷酸化Akt抗体(美国Cell Signalling Technology公司)其他抗体(美国Santa Cruz公司)SYBR Green(Solarbio公司)羊抗鼠和羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)MTS(美国promega公司)ELISA试剂盒(美国BioLegend公司)流式(AnnexinV/PI)试剂盒(美国BD公司)1.2主要仪器JEM-1200EX电镜(日本,JEOL公司)UP50超声粉碎仪(德国,Dr.Hielscher公司)TLL-C台式高速冷冻离心机(北京四环科学仪器厂)TGL-16G台式高速离心机(北京四环科学仪器厂)DLL-B低速冷冻离心机(北京四环科学仪器厂)WD-9405型生化摇摆平台(北京沃德生物医学仪器公司)FA(N)电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)79HW-1型恒温磁力搅拌器(浙江乐成电器厂)DYY-Ⅲ-8B稳压稳流型电泳仪(北京市六一仪器厂)DYY-Ⅲ型电泳槽(北京市六一仪器厂)Tanon EPS 300电泳仪(上海天能科技有限公司)Tanon GIS 2020成像分析照相系统(上海天能科技有限公司)DH 4000 AB型电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)500型酶标仪(美国,BIO-RAD公司)CK 40倒置显微镜(日本,OLYMPUS公司)BX 41显微镜(日本,OLYMPUS公司)700型显微照相镜(日本,OLYMPUS公司)4℃/-20℃电冰箱(海尔集团公司)-80℃深低温冰箱(日本,SANYO公司)超净台(苏州净化设备厂)SYQ·MDX-280高压锅(上海申安医疗器械厂)HH·SII-1水浴箱(北京长安科学仪器厂)2.实验方法2.1细胞培养结肠癌细胞株HT-29、RKO于本实验室进行常规传代培养,用含有10%灭活胎牛血清、12 U/ml庆大霉素的RPMI1640培养液,于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养,0.25%胰酶消化液消化传代,2-3天传代一次。所有实验均采用对数生长期细胞。2.2 MTS法检测结肠癌细胞的活力将结肠癌细胞HT-29、RKO、计数3000个/孔,配置成200ul 10%血清的培养基,混匀,均匀种于96孔板,设置对照组和处理组,并将无细胞的培养基设置为空白对照组,每组3个副孔。待24小时细胞充分贴壁后加入处理因素,并放入37℃培养箱中孵育。处理结束后,每孔加入20ul MTS溶液,轻摇混匀后置于37℃培养箱中,4小时后取出,酶标仪在490nm波长下检测吸光度(OD)值,根据OD值计算处理因素对HT-29、RKO细胞活力的影响。2.3 siRNA转染siRNA购于广州市锐博生物科技有限公司,结肠癌细胞以3×10~5/孔接种在6孔板上,24小时后,将Lipofectamin 2000稀释于无血清无抗生素的RPMI1640培养液中轻轻混匀,将对照组siRNA、STAT3 siRNA分别稀释于无血清无抗生素的RPMI1640培养液中,室温静置5分钟,将不同siRNA分别与Lipofectamin 2000混合,室温静置20分钟。弃掉原6孔中的培养液,使用双无培养液洗细胞2次,将每个培养孔中加入的无血清无抗生素RPMI1640培养液。再将总体积为的混合液加入培养孔中,轻轻摇动,使其分布均匀。培养箱孵育细胞16小时后,更换含血清及抗生素RPMI1640培养液,转染48小时后收样,采用western blot方法检测蛋白表达确定转染效率。2.4 Western Blotting检测蛋白水平分别收集对照组与处理组细胞裂解于70ul含有蛋白酶抑制剂(100μg/ml PMSF,2μg/ml Aprotitin)的RIPA裂解液中[0.1%SDS,1%Triton-100,150mmol/LNaCl,1 mmol/L EDTA(PH8.0),10 mmol/L Tris-HCl(PH 7.5)],4℃裂解40分钟,13,000 rpm离心20分钟,吸取上清,考马斯亮蓝曲线法进行蛋白定量。与3×样品缓冲液混合后,煮沸5分钟。将样品(30-50μg/lane)在12%的SDS-聚丙烯凝胶中进行电泳2-3小时,然后转印至PVDF膜上(电压:2 mV/cm2;时间:120分钟)。用5%脱脂牛奶封闭1小时后,按预染Marker标记的分子量剪裁转印膜,分别加入兔抗人p-STAT3(1:250)、STAT3(1:1000)、p-Akt(1:500)、Akt(1:1000)、p-ERK(1:2000)、ERK(1:1000)、BCL-2(1:250)、Caspase3(1:500)、BIM(1:1000)、PUMA(1:1000)、PARP(1:1000)、Actin(1:1000)抗体,4℃过夜。TTBS洗4次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1:1000)或羊抗兔二抗(1:1000)室温作用30分钟,ECL法显色,GIS凝胶图像分析系统照相并分析处理。2.5流式细胞术(AnnexinV/PI)检测细胞凋亡率将细胞用胰蛋白酶消化,充分吹吸均匀,用PBS洗涤并重悬于200μl binding buffer缓冲液中。接下来,将5μl AnnexinV-FITC加入到195-μl细胞悬液中。在室温下混匀并孵育10分钟,用200μl结合缓冲液洗涤细胞并重悬于190μl结合缓冲液中。然后加入10μl PI(20μg/ml),通过流式细胞仪(BD Accuri C6 Flow Cytometer,BD Biosciences)检测样品,并用WinMDI2.9版软件(The Scripps Research Institute,La Jolla,CA,美国)对样品数据分析。2.6 ELISA定量分析细胞因子含量将HT-29和RKO细胞以1×10~5个细胞/孔的密度接种在6孔板中,24小时待细胞贴壁后,用去血清去抗生素的RPMI-1640培养液冲洗贴壁细胞2遍,后在双无RPMI-1640培养液体系设置处理组与对照组。37℃培养箱孵育,将对照组与处理组的培养上清液收集并计数细胞数量,以备检测。检测前一晚,PBS1:1000稀释IL-6一抗,以100μl的一抗体系包被ELISA检测上样板,4℃保存过夜。次日用试剂盒洗涤液以200μl/孔洗上样孔3遍,1X封闭液以200μl/孔的体系室温下封闭1小时,倒掉封闭液后继续用洗涤液洗3遍。以100μl/孔的体系上样以及标准品,室温下孵育2小时,之后按前法洗涤3遍,以100μl/孔的体系上样二抗(1:200稀释),室温孵育2小时后洗涤3遍,以100μl/孔的习题上样HRO,室温孵育20分钟,之后按前法洗涤。显色液A:B按1:1的比例混合,100μl/孔的体系上样,室温避光孵育20分钟后终止液(50μl/孔)终止,酶标仪在570nm波长下检测吸光度(OD)值,根据标准品的OD值制作标准品曲线,将样品OD值带入曲线后,得到样品数据进行分析。2.7集落形成试验测定细胞增殖细胞以500个细胞/孔在12孔板中接种,在含有10%FBS的RPMI-1640培养基中于37℃培养箱培养24小时后,设置对照组和处理组,每组设3个副孔,37℃培养箱培养10天,收样的第一天,吸净培养液,PBS洗3遍,吸净培养液,室温下敞口风干。第二天将瑞式染液以400μl/孔加入12孔板,混匀静置1分钟,然后以600μl/孔加入吉姆染液混匀静置40分钟后,用自来水讲孔板背景冲洗干净,在光学显微镜(BX53F,Olympus,Tokyo,Japan)下计数细胞数。2.8 Transwell法测定细胞迁移使用8mm的transwell室(Corning Life Sciences,Teterboro,NJ,USA)进行迁移测定。将含有4×10~4 HT-29、RKO细胞去血清的的200μl RPMI-1640培养液中的加入至每个上部小室,下室加入含2%FBS的RPMI-1640培养液,并在下室加入处理因素,设置对照组和处理组,72小时后,使用含酒精的棉签清除小室内的非迁移细胞并固定,而迁移至膜底部的细胞通过瑞式染液染色1分钟,然后加入吉姆萨染液混匀静置40分钟,对染色的细胞进行计数并成像。计算至少四个随机选择的细胞数,取均值。2.9体内实验将RKO细胞以3X10~6个细胞/只注入裸鼠皮下,10天后形成肿瘤,肿瘤大小50-120mm~3,平均分组后,按照25mg/kg的浓度将维罗非尼和stattic灌入裸鼠胃中,每3天测量裸鼠的体重与肿瘤的长短径,计算肿瘤体积,给药12天后解剖裸鼠,将肿瘤分离,对肿瘤体积进行分析,肿瘤体积按照长径X短径~2/2来计算,并做肿瘤体积曲线。2.10统计学分析所有数据均为3次独立实验结果,以均值±标准差(x±s)表示。采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。两组之间比较采用t检验及Two-way ANOVA,P<0.05有统计学意义。结果:1.BRAFV600E突变的结肠癌细胞对维罗非尼的敏感性不同。不同浓度的维罗非尼(0,0.2,1,5μM)处理HT-29、RKO细胞24、48、72小时后,通过MTS实验检测细胞活力,HT-29细胞活力抑制率明显高于RKO细胞,并且抑制率呈时间依赖以及浓度依赖的方式。通过流式细胞术(AnnexinV/PI双染法)检测维罗非尼处理后细胞的凋亡率,结果证实维罗非尼(5μM)处理12小时后HT-29细胞凋亡高于RKO细胞,通过免疫印迹方法检测维罗非尼(5μM)处理12小时后相关凋亡蛋白(Caspase3,cleaved-Caspase3,BIM,PUMA,PARP,cleaved-PARP),结果证实HT-29细胞凋亡蛋白上调相对明显,RKO细胞凋亡蛋白上调相对较小。综上结果证实HT-29细胞为维罗非尼相对敏感细胞系,RKO细胞为维罗非尼相对耐药细胞系。2.维罗非尼诱导RKO细胞分泌IL-6激活STAT-3上调BCL-2来产生耐药性。固定维罗非尼浓度(5μM)处理HT-29、RKO细胞0,2,6,12,24小时后,免疫印迹方法检测p-ERK,ERK,p-STAT3,STAT3,p-Akt,Akt,BCL-2,Actin蛋白表达,结果发现RKO细胞在加药处理后的第6小时开始激活STAT3,而抗凋亡蛋白BCL-2同时上调,HT-29细胞并没有激活STAT3信号,同时BCL-2未表达。同时我们发现维罗非尼对HT-29细胞抑制ERK活化相对较强,对RKO抑制相对较弱。ELISA检测维罗非尼处理后细胞上清IL-6的分泌情况,以明确STAT3的上调是否与经典的IL-6/STAT3通路激活相关。将细胞种于六孔板后,加10%进口小牛血清的培养液促使细胞生长及贴壁,24小时后用去血清去抗生素的培养液洗细胞3次,将培养体系换成双无培养液后加入维罗非尼(5μM)处理12小时,取细胞上清液进行ELISA检测IL-6的分泌,结果证实RKO细胞分泌IL-6升高,而HT-29细胞未有IL-6分泌。上述结果证实分泌的IL-6激活STAT3信号上调BCL-2的表达导致了RKO细胞的耐药性产生。3.中和RKO分泌的IL-6后,STAT3活化被抑制同时BCL-2未上调,细胞活力降低。免疫印迹法检测RKO细胞经过IL-6中和抗体(50 ng/ml)和维罗非尼(5μM)处理12小时后p-STAT3,STAT3,BCL-2的表达。结果发现,在无血清培养基中,RKO细胞经过维罗非尼(5μM)处理12小时后STAT3活化同时上调BCL-2的表达,而当联合IL-6中和抗体后,STAT3未激活,BCL-2未上调。同时ELISA检测到维罗非尼促进IL-6分泌,联合IL-6中和抗体后细胞上清中的IL-6无升高变化。MTS检测显示在维罗非尼联合IL-6中和抗体可以进一步降低细胞活力,在一定程度上增敏RKO细胞对维罗非尼的反应性。上述结果进一步提示,在RKO细胞中,STAT3的活化是由于IL-6分泌导致的,从而导致了细胞的相对耐药。4.STAT3抑制剂有效增敏耐药细胞RKO对维罗非尼的反应性。MTS法检测STAT3抑制剂stattic联合维罗非尼以及siRNA瞬时转染敲除STAT3联合维罗非尼对细胞活力的影响,结果发现联合72小时后细胞活力受到明显抑制。集落形成试验检验细胞增殖速度,结果显示,RKO细胞经维罗非尼(1μM)联合stattic(1μM)处理后比单药处理细胞增殖抑制更加明显。免疫印迹法证实维罗非尼(5μM)联合stattic(2μM)用药处理12小时后相关凋亡蛋白(Caspase3,cleaved-Caspase3,BIM,PUMA,PARP,cleaved-PARP)信号均有明显上调。流式细胞术(AnnexinV/PI双染法)检测同时验证了联合处理12小时后细胞凋亡率得到明显的增加。为了进一步探索信号在联合用药后的变化,利用免疫印迹法检测维罗非尼(5μM)联合stattic(2μM)后p-ERK,ERK,p-STAT3,STAT3,BCL-2,Actin,结果证实stattic(2μM)预处理2小时后,维罗非尼无法在12小时后有效的激活STAT3,而BCL-2也无显著上调,利用siRNA瞬时转染敲除STAT3后,联合维罗非尼得到同样趋势的信号。上述结果证实,维罗非尼通过激活STAT3,影响BCL-2的表达从而导致了RKO细胞对维罗非尼的耐药。5.激活HT-29细胞的STAT3信号可以上调BCL-2的表达,促使敏感细胞耐药。免疫印迹法证实HT-29细胞经IL-6(1ng/ml)处理1小时至24小时持续活化STAT3,BCL-2在STAT3活化之初未上调表达,而在处理12小时后BCL-2的表达上调。IL-6可以提高HT-29的细胞活力,MTS证实IL-6可以使维罗非尼对HT-29细胞的抑制率得到下降,而在集落形成试验中却发现IL-6处理7天后没有明显促进细胞增殖。但在随后的细胞迁移测定中,通过TRANSWELL试验证实IL-6(50ng/ml,100ng/ml)处理72小时后可以促进HT-29及RKO细胞的迁移。为进一步验证信号通路的变化,免疫印迹法检测IL-6(1ng/ml)、维罗非尼(5μM)、stattic(2μM)单药、两药以及三药联合后HT-29细胞信号的变化,发现经stattic(2μM)预处理2小时后IL-6(1ng/ml)无法激活STAT3,同时BCL-2无表达,而IL-6激活STAT3后促进了BCL-2的表达。以上结果表明,敏感细胞HT-29经过IL-6激活STAT3,上调BCL-2表达,可以使敏感细胞变为耐药细胞。6.维罗非尼反馈激活EGFR信号促进耐药的产生。免疫印迹法验证RKO细胞在经过维罗非尼(2μM)处理48小时后p-EGFR上调,HT-29细胞经维罗非尼(2μM)处理后p-EGFR仍表达,这就说明EGFR的活化可能导致肠癌细胞对维罗非尼的耐药,需要进一步抗EGFR处理来证明。7.西妥昔单抗通过抑制EGFR的激活有效增敏细胞对维罗非尼的反应性。集落形成试验显示,联合维罗非尼(1μM)和西妥昔单抗(10μg/ml)作用7天可以起到协同抑制细胞增殖的作用。免疫印迹法验证信号通路,显示经过西妥昔单抗(50μg/ml)处理后活化的EGFR信号被抑制。同时MTS验证了单药西妥昔单抗(50μg/ml)对细胞的抑制作用不明显,而西妥昔单抗(50μg/ml)联合维罗非尼(2μM)处理72小时,细胞活力有明显的抑制。流式细胞术(AnnexinV/PI双染法)显示联合用药48小时后,细胞凋亡率明显上升。这也证明了西妥昔单抗可以通过抑制EGFR信号的激活来增敏维罗非尼对肿瘤的抑制作用。8.西妥昔单抗激活STAT3信号。免疫印迹法显示,RKO细胞中不论是经过维罗非尼(2μM)还是西妥昔单抗(50μg/ml)48小时后都可以诱导其激活STAT3信号,进一步ELISA验证,二者都是通过促进IL-6的分泌来激活STAT3信号。9.STAT3抑制剂抑制维罗非尼和西妥昔单抗激活的STAT3信号,进一步提高细胞的敏感性,增强三药联合的作用,使三药联合治疗成为可能。通过免疫印迹法验证了西妥昔单抗可以下调p-EGFR的表达来增敏维罗非尼对肿瘤细胞的抑制作用,STAT3抑制剂可以抑制维罗非尼、西妥昔单抗双重激活的STAT3信号,使三药联合时起到互相增敏的连环效应。同时,MTS、集落形成试验、流式细胞术(AnnexinV/PI双染法)检测均验证了三药联合可以对细胞活力、细胞增殖起到明显的抑制作用,并明显提高细胞凋亡率。结论:1.BRAFV600E突变的结肠癌细胞对维罗非尼的敏感性不同。2.维罗非尼使RKO细胞分泌IL-6激活STAT-3细胞上调BCL-2来产生耐药性。3.STAT3抑制剂有效增敏耐药细胞RKO对维罗非尼的反应性。4.激活HT-29细胞的STAT3信号可以上调BCL-2的表达,促使敏感细胞耐药。5.维罗非尼反馈激活EGFR信号促进耐药的产生。6.西妥昔单抗通过抑制EGFR的激活有效增敏细胞对维罗非尼的反应性。7.西妥昔单抗激活STAT3信号。8.STAT3抑制剂抑制维罗非尼和西妥昔单抗激活的STAT3信号,进一步提高细胞的敏感性,增强三药联合的作用,使三药联合治疗成为可能。