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白粉病、纹枯病和赤霉病是小麦生产中严重的病害,可造成严重的减产。抗病遗传育种是防御这些病害的重要途径。但白粉病菌生理小种变异快,使用少数几个抗病基因进行抗性育种易引起寄主较快丧失抗性。而易于利用的小麦纹枯病和小麦赤霉病的抗性资源也非常缺乏,从而导致抗病育种进展缓慢。因此,研究寄主抗病反应分子机制,分离具有广谱作用的抗病信号传导调控基因,是目前抗病遗传育种发展方向之一。系统获得抗性(SAR)是一种对多种真菌具有广谱抗性的诱导防卫反应抗性,它的发生伴随着系统性水杨酸(SA)含量的增加和病程相关(PR)蛋白的表达。病程相关基因非表达子1(NPR1)是SAR的重要转录因子,NPR1与细胞核内的包含碱性亮氨酸拉链(bZIP)的TGA转录因子相互作用,引起下游抗病基因的表达,从而提高寄主对多种病害的抗性。荆州黑麦是发现于我国湖北荆州地区的栽培黑麦，具有良好的赤霉病、纹枯病和白粉病抗性。因此,分离与克隆荆州黑麦中NPR1同源基因,不仅有利于揭示荆州黑麦的抗病机制,还可用于小麦抗病分子育种。本研究以拟南芥NPR1基因保守序列设计引物,从荆州黑麦分离得到NPR1同源基因全长cDNA序列,以生物信息学方法对其基因结构进行了分析,在此基础上研究了该基因在不同组织和病原菌及植物抗病相关信号分子诱导下的表达特征,以明确该基因的功能,为转基因抗病品种的培育提供依据。获得的具体结果如下:
1、根据同源序列设计简并引物,利用同源序列法和SMARTer-RACE技术从荆州黑麦中克隆得到NPR1同源基因的全长cDNA序列,具有ANK结构保守序列,命名为ScNPR1(专利号为:201010556657.8)。根据得到的编码区核苷酸序列推测,该基因编码一条507个氨基酸残基的多肽,其中含有BTB/POZ和锚蛋白重复序列,核苷酸序列分析发现,在起始密码子上游存在4个W框。通过序列比对发现,对NPR1功能起关键作用的氨基酸在不同物种中均具有保守性,如nprl-1(H),nprl-2(C)和niml-4(R)。进化树分析表明:该氨基酸序列与已知的小麦、水稻NPR1基因同源性均较高,分别达到92.4％和90.3％。
2、实时荧光定量PCR结果表明:ScNPR1在荆州黑麦中的表达具有组织特异性,叶中的表达量明显高于其他部位,而穗中的表达量只有叶的20％左右,具有显著的组织表达差异。在SA、JA、ET等信号分子的诱导下,ScNPR1的表达量明显增加,并且SA和JA处理8h时表达量最高,随后降低,ET处理4h后表达量最高,随后降低。这暗示了荆州黑麦中的ScNPR1基因可能是SA和ET依赖的信号转导途径的成员。本研究还发现白粉病菌、纹枯病菌和禾谷镰刀菌的诱导能增强NPR1基因的表达。白粉病菌、纹枯病菌和禾谷镰刀菌诱导下NPR1基因的表达情况有所不同,初步推测结果可能与这3种病原菌侵染植物的过程和模式有关,ScNPR1可能以不同的表达方式参与了上述3种病原菌的防御反应。
3、为了解ScNPR1在荆州黑麦中的存在形式,实验以ScNPR1为探针与BamHI、HindⅢ限制内切酶消化的荆州黑麦基因组DNA进行Southern杂交分析,结果表明,ScNPR1以两个拷贝的形式存在于荆州黑麦基因组中。为了研究ScNPR1在荆州黑麦染色体上的定位,设计SNAP引物,利用荆州黑麦和辉县红的添加系DNA为模板进行PCR,结果表明该基因定位在荆州黑麦6R和7R染色体上。
4、将ScNPR1构建正义植物表达载体pCAMBIA2301-ScNPR1,采用农杆菌介导的方法,转化普通烟草。经卡那霉素和头孢霉素筛选获得若干再生植株。经过PCR鉴定,并选取部分转基因植株进行了Southern杂交分析,结果证明ScNPR1在转基因烟草中已成功得到表达。分别选取转基因阳性植株和对照植株进行抗真菌实验,结果表明转基因阳性植株的抗病能力明显高于对照植株。
5、利用绿色荧光蛋白在洋葱表皮瞬时表达的实验,证明了ScNPR1蛋白可以通过SA、JA诱导而引起细胞内氧化还原电位势的变化,从细胞质运动到细胞核之中,证明该基因可能具有抗病功能。