促卵泡生成素(follicle stimulating hormone, FSH)和黄体生成素(1uteinizing hormone, LH)是由垂体分泌的两种促性腺激素(gonadotropin, Gn)。在正常的排卵周期中,FSH和LH协同发挥作用,对调控卵泡生长、卵母细胞成熟、排卵、黄体形成以及甾体激素分泌产生重要影响。在不同卵泡发育阶段,卵泡对FSH和LH的需求不同。在优势卵泡确立之前,FSH发挥主要作用,决定着卵泡募集、选择以及优势卵泡的确立：在优势卵泡选择后,LH逐渐发挥主导作用,决定卵泡发育的最后成熟、排卵。卵泡发育的这一特性,提示可能存在一种适宜卵泡生长的LH/FSH比例范围,通过调节这个LH/FSH比例来满足不同阶段卵泡发育的需要。研究发现,在FSH浓度达到卵泡生长需要的前提下,若LH水平的过低,会导致卵泡膜细胞的雄激素分泌减少,减少窦卵泡的募集；同时雌激素合成的原料减少,使卵泡生长早期的雌激素微环境失衡,降低卵泡质量。而过高的LH水平则可能导致卵泡闭锁和黄素化、卵母细胞及胚胎发育不良、甾体激素分泌失调等。因此,适宜的LH/FSH比例对卵泡发育和甾体激素分泌具有重要意义。然而,目前关于LH/FSH比例对卵泡发育、甾体激素分泌等生殖功能的影响的研究并不多,对其在不同卵泡发育阶段发挥的作用及机制仍不清楚。在辅助生殖技术(artificial reproduction technology, ART)中,重组人卵泡刺激素(recombinant human follicle stimulating hormone, rhFSH)和重组人黄体生成(recombinant human1uteinizing hormone, rhLH)的问世,给ART临床治疗提供了灵活多变的FSH和LH组合的多种超促排卵方案。但无论单独用FSH或FSH联合LH,都是在一定FSH的基础上调整LH的用量,以求接近最适宜卵泡发育的LH/FSH比例。然而卵巢刺激方案中最适宜的LH/FSH比例一直存在着争议。所以,我们需要一个清晰、适宜的LH/FSH比例范围给临床治疗提供参考。因此,本实验采用不同LH/FSH比例的超促排卵方案刺激未性成熟小鼠,通过比较观察其对卵泡发育及甾体激素生成的影响,来探索最适宜卵泡发育的LH/FSH比例范围,从而为卵巢功能的研究提供理论基础,同时也为临床超促排卵方案的制定提供参考依据。不同超促排卵方案也会影响人卵泡上的基因表达的差异最终影响临床结局。因此,本实验的主要观察参数采用了11个LH诱导的影响卵泡发育和甾体激素分泌的基因,包括参与调节甾体激素合成的LHCGR(编码LH/HCG受体)、STARD1(编码类固醇激素急性调节蛋白)、CYP11A1(编码细胞色素P450侧链裂解酶)、SULT1E1 (编码雌激素磺基转移酶)基因；参与调节卵母细胞成熟的AREG(编码双调蛋白)、EREG(编码表皮调节素)、BTC(编码β细胞素)基因；促进排卵前卵泡卵丘细胞基质扩展的PTGS2(编码环氧化酶-2)、HAS2(编码透明质酸合成酶2)、TNFAIP6(编码肿瘤坏死因子-α诱导蛋白6)、PTX3(编码五聚素3)基因。[目的]第一部分实验：观察不同LH/FSH比例的超促排卵方案对小鼠卵巢卵泡发育、甾体激素分泌的相关基因mRNA表达的影响。第二部分实验：观察不同LH/FSH比例的超促排卵方案对小鼠卵巢卵泡发育的形态学改变。[材料和方法]1.动物实验设计第一部分实验：将63只出生21-23天的雌性昆明小白鼠随机分成5组,按不同超促排卵方案分为3个实验组(每组15只)1个实验对照组(15只)、1个对照组(3只)。实验组分别为F组(总量10IU rhFSH)、F/L组(总量10IUrhFSH+总量10IU rh LH)、F/2L组(总量10IU rhFSH+总量20IU rhLH)；实验对照组为P组,注射5IU孕马血清促性腺激素(pregnant mare’s serum gonadotropin, PMSG);空白对照组为22日龄小鼠。采用腹腔注射方式,F组、F/L组、F/2L组每12h给药一次。在首次注射Gn后48h,各实验组及实验对照组均注射绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG) 5 IU。空白对照组注射等体积生理盐水。分别在首次注射Gn后44h、HCG后4h、HCG后8h、HCG后14h、HCG后48h采集实验组及实验对照组双侧卵巢标本：空白对照组在第一个时间点取双侧卵巢。组织标本存于-80。C冰箱备检测。各实验组及实验对照组每个时间点为3只小鼠。第二部分实验：27只雌性昆明小白鼠采用与第一部分实验相同的分组、超促排卵方案处理,3个实验组、1个实验对照组在每个时间点均为3只小鼠,空白对照组3只小鼠。分别在注射HCG后8h、HCG后48h取双侧卵巢标本,甲醛固定过夜,酒精脱水后,备用于HE染色。2、实验方法第一部分实验：提取卵巢RNA后采用逆转录聚合酶链反应(reversetranscription PCR,RT-PCR)进行相对定量,检测不同超促排卵方案在各个时间点对小鼠卵巢LHCGR、STARD1、CYP11A1、SULT1E1、AREG、EREG、BTC、 PTGS2、HAS2、TNFAIP6、PTX3的 mRNA表达的影响。第二部分实验：对实验组、实验对照组的HCG 8h、HCG 48h时的卵巢组织及空白对照组卵巢组织行HE染色,观察卵巢的形态学改变。3.统计方法用17.0软件进行统计分析,计量资料结果以均数士标准差(x±s),设双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。采用析因分析进行统计学检验,并分析交互效应、主效应和单独效应。[结果]一、不同超促排卵方案对小鼠卵巢甾体激素合成相关基因LHCGR、STARD1、 CYP11A1、SULT1E1的mRNA表达的影响1、LHCGR mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=13.395,p<0.001); STARD1 mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=7.139, P<0.001); CYP11A1 mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=3.389, P=0.002)。SULT1E1 mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=2.283, P=0.025)。2、在Gn 44h时LHCGR mRNA在F/L组高于F组和F/2L组。3、在Gn 44h时STARD1 mRNA在F/2L组高于P组、F组和F/L组。4、在Gn 44h时CYP11A1 mRNA在F/2L组高于F组、F/2L组；F/L组高于F组。5、F组SULT1E1 mRNA表达在HCG 4h和HCG 8h时之间差异无统计学意义；F/2L组SULT1E1 mRNA表达在HCG 4h和HCG 8h时之间差异无统计学意义。6、在HCG 48h时LHCGR mRNA在P组高于F组、F/L组和F/2L组。7、在HCG 48h时STARD1 mRNA在P组高于F组、F/L组和F/2L组。8、在HCG 48h时CYP11A1 mRNA在P组高于F组、F/L组和F/2L组。二、不同超促排卵方案对小鼠卵巢卵母细胞成熟相关基因AREG、EREG、BTC的mRNA表达的影响1、AREG mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=9.816, P=0.029)。EREG mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=2.222, P=0.029)。BTC mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=2.140,P=0.036)。2、在HCG 4h时AREG mRNA在F/L组高于P组、F组、F/2L组。3、在HCG 4h时EREG mRNA在F/L组高于P组、F组、F/2L组。4、在HCG 4h时BTC mRNA在F/L组高于F组、F/2L组。三、不同超促排卵方案对小鼠卵巢卵丘扩展相关基因PTGS2、HAS2、TNFAIP6、 PTX3的 mRNA表达的影响1、PTGS2 mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=12.267,P<0.001)。HAS2 mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=28.135,P<0.001)。TNFAIP6 mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=4.071,P<0.001)。PTX3 mRNA相对表达量在超促排卵方案和时间点之间存在交互作用(F=16.908,P<0.001)。2、在HCG 4h时PTGS2 mRNA在F/L组高于P组、F组和F/2L组。3、在HCG 4h时HAS2 mRNA在F/L组高于P组、F组和F/2L组。4、在HCG 4h时TNFAIP6 mRNA在F/L组高于P组、F组、F/2L组。5、在HCG 4h时PTX3 mRNA在F/L组高于P组、F组和F/2L组。四、不同超促排卵方案对小鼠卵巢的形态学改变1、不同超促排卵方案对HCG 8h时小鼠卵巢的形态学改变HCG 8h时卵巢组织切片HE染色可见镜下P组卵巢有处于不同发育阶段的卵泡。F/L组小鼠卵巢生长卵泡的比例较F组、F/2L的生长卵泡的比例明显增加,卵丘扩展良好。F组生长卵泡比例显著减少,卵丘颗粒细胞在HCG 8h时扩展不明显,颗粒细胞排列紧密,出现少量壁层颗粒细胞凋亡。F/2L组生长卵泡比例比F/L组显著减少,颗粒细胞层数减少,排列疏松,可见较多颗粒细胞凋亡,其卵泡内卵母细胞或放射冠消失,甚至部分卵泡退化。2、不同超促排卵方案对HCG 48h时小鼠卵巢的形态学改变卵巢组织切片HE染色低倍镜下可见P组小鼠卵巢较F组、F/L组、F/2L组黄体数目多,且黄体直径大；F组、F/L组、F/2L组均可见未排卵卵泡,且黄体终末分化不良。高倍镜下可见,与P组相比,F组、F/L组、F/2L组的黄体细胞出现更多的细胞核浓缩、细胞质减少、细胞缝隙增宽,尤以F/2L组为甚。[结论]1、卵泡发育早期,过高LH/FSH比例的超促排卵方案使晚期生长卵泡CYP11A1、STARD1过早表达,提前出现颗粒细胞黄素化,继而使颗粒细胞甾体激素分泌功能异常和颗粒细胞过早凋亡。2、卵泡发育早期,过低LH/FSH比例甚至无LH的超促排卵方案使卵泡LHCGR、卵母细胞成熟及卵丘扩展相关基因表达减少,导致生长卵泡显著减少,晚期生长卵泡卵丘扩展不良,所以卵泡生长期仅有FSH刺激不利于卵泡发育以及卵泡对FSH刺激的反应。3、r FSH联合r LH的超促排卵方案在小鼠中以FSH:LH为1：1是最佳比例的超促排卵方案。但与PMSG相比,过低及过高LH/FSH比例的卵巢刺激方案在卵泡晚期不能下调SULT1E1基因、三种重组G11的卵巢刺激方案在黄体期均不能上调CYP11A1、LHCGR、STARD1基因,导致小鼠卵巢黄体功能不健。因此相比而言,PMSG更适合用于小鼠促排卵方案,但其机理需进一步研究。