论文部分内容阅读
1-磷酸鞘氨醇及中性神经酰胺酶保护炎症因子引起的胰岛β细胞凋亡目的:(1)观察外源性1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)是否减少炎症因子引起的胰岛β细胞凋亡。(2)探讨S1P保护胰岛β细胞的可能机制。(3)观察胰岛β细胞是否存在中性神经酰胺酶(neutral ceramidase,N-CDase)活性及表达。(4)观察炎症因子刺激是否引起胰岛β细胞N-CDase的活性及表达变化。(5)观察抑制N-CDase活性是否影响炎症因子引起的胰岛β细胞凋亡。方法:(1)贴壁法培养大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞,联合应用炎症因子白介素-1β(IL-1β,5 ng/mL)、肿瘤坏死因子(TNF-α,10 ng/mL)和干扰素-γ(IFN-γ,50 ng/mL)刺激INS-1细胞24 h,流式细胞术检测细胞凋亡。(2)1μM S1P预处理INS-1细胞1h,随后,应用炎症因子及S1P与INS-1细胞共培养24h,流式细胞术检测细胞凋亡。(3)western-blot方法检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3的表达。(4)应用有机萃取和高效液相色谱(HPLC)方法定量测定正常培养以及炎症因子刺激下INS-1细胞的N-CDase的活性。(5)采用半定量RT-PCR和定量real-time PCR方法测定正常培养以及炎症因子刺激下INS-1细胞的N-CDase基因表达,western-blot方法检测N-CDase蛋白表达。(6)应用N-CDase抑制剂D-MAPP(终浓度为10μM)抑制INS-1细胞N-CDase活性,HPLC方法测定抑制后酶活性的降低。(7)应用D-MAPP与炎症因子共培养INS-1细胞24 h,流式细胞术测定细胞凋亡。结果:(1)INS-1细胞贴壁生长状况良好,正常培养条件下凋亡不明显;而联合应用炎症因子IL-1β、TNF-α和IFN-γ刺激24 h后INS-1细胞出现明显凋亡。(2)应用1μM S1P预处理INS-1细胞并与细胞共培养,能显著减少炎症因子引起的细胞凋亡。(3)应用1μM S1P预处理并与INS-1细胞共培养,能显著抑制炎症因子刺激下的细胞cleaved-caspase-3的表达。(4)正常培养的INS-1细胞存在一定的N-CDase活性,炎症因子刺激能明显增加INS-1细胞的N-CDase活性:最早在刺激8h后即能观察到N-CDase活性明显增加,在刺激16h后达到高峰,并且,这种增加在刺激24h后仍能被检测到。(5)炎症因子刺激能明显增加INS-1细胞的N-CDase蛋白表达,并与其活性增加的时间依赖性较一致。(6)炎症因子刺激能明显增加INS-1细胞的N-CDase基因表达,在刺激4h后出现N-CDase基因表达显著增强,刺激12h后达到高峰。(7)应用10μM D-MAPP预处理及与INS-1细胞共培养,能明显降低正常培养和炎症因子刺激的INS-1细胞的N-CDase活性。(8)应用10μM D-MAPP预处理及与INS-1细胞共培养,能明显增加炎症因子刺激引起的INS-1细胞凋亡。结论:(1)联合应用炎症因子刺激24h能引起INS-1细胞凋亡,而外源性S1P能减轻炎症因子引起的细胞凋亡。(2)S1P可能通过抑制凋亡相关蛋白cleaVed-caspase-3表达,从而减轻炎症因子引起的INS-1细胞凋亡。(3)INS-1细胞存在N-CDase活性,炎症因子刺激可引起N-CDase的活化,并且,其活性增高可能与对抗炎症因子引起的细胞凋亡有关。