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目的建立小鼠骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)系作为细胞模型,采用RNA-seq技术结合生物信息学手段,分析人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)对小鼠骨髓EPCs增殖影响的差异表达基因及其主要意义,探讨人参皂苷Rg1对小鼠骨髓EPCs促增殖作用的分子机制,为利用人参皂苷Rg1治疗内皮损伤性疾病提供分子生物学水平依据,同时寻找促进EPCs体外生长的关键靶点,为培养数量充足、富有活力的EPCs提供新思路。方法1.采用全骨髓差速贴壁培养法与二次酶消化法相结合,分离和纯化小鼠骨髓EPCs。通过形态学观察、细胞表面抗原表达率检测,进行所获EPCs的细胞鉴定。2.在EPCs的传代培养过程中,选择增殖能力强的细胞,通过有限稀释培养获得单克隆细胞系,并进行传代培养扩增。通过形态学观察、生长特性观察、细胞表面抗原检测、核型分析、体外成血管实验,进行所建细胞系MBMME2的鉴定。3.取小鼠骨髓EPCs的传代细胞和细胞系MBMME2细胞,每种细胞分为7个组,即4个人参皂苷Rg1处理组(终浓度分别为5、10、15、20μmol/L),空白对照组、溶剂对照组(1.25‰乙醇)和阳性对照组(10_-~8μmol/L雌激素),培养96 h,用MTT法检测细胞增殖水平。取小鼠骨髓EPCs传代细胞,按上述分为7个组,培养3周,观察集落形成能力。以上每种细胞分为10μmol/L人参皂苷Rg1组和溶剂对照组,培养96 h,用流式细胞术进行细胞周期分析。4.将MBMME2细胞分为4个组,即3组人参皂苷Rg1处理组(终浓度分别为5、10、20μmol/L)和溶剂对照组,培养96 h,收集总RNA样本,构建cDNA文库、HiSeq测序,建立转录组数据库。经差异表达分析,筛选出差异表达基因(DEGs),并以DEGs为对象进行基因功能注释、信号通路富集分析,以及蛋白质互作网络分析。根据RNA-seq分析结果,选出20个DEGs进行RT-qPCR验证。结果1.分离和纯化所获小鼠骨髓内EPCs贴壁生长良好,细胞多为短梭形或椭圆形。细胞传代接种后,早期形成集落,逐渐长大,而至汇合。较大集落中心的细胞重叠,外围细胞为单层,形态清晰。单层细胞密集时,呈典型的铺路石样排列。所获EPC传代细胞的表面抗原阳性细胞率检测显示,CD90为97.1%,CD133为83.4%,CD34为90.8%,CD29为23.5%,CD45为8.8%。2.本研究建立的细胞系MBMME2为连续传代细胞系,具有EPCs的一般生物学特征。细胞贴壁生长速率高,对血清的依赖性低,5%FBS的生长培养基能维持细胞的快速增殖。细胞增殖指数为44.8%～47.9%。流式细胞朮检测显示,CD90、CD133、CD34、CD31和CD45的阳性细胞率依次为99.7%、36.4%、96.8%、97.5%和0.1%,并得到细胞免疫荧光染色结果的支持。染色体核型多为三倍体。体外成血管实验显示,细胞能排列成多个管横截面样的网络状结构。本细胞系传代方便,大集落和融合层上浮的细胞即能接种培养。3.在人参皂苷Rg1浓度为5～20μmol/L的条件下培养96 h后,小鼠骨髓EPCs的传代细胞和细胞系MBMME2细胞的MTT实验结果显示,两种细胞的吸光值均随人参皂苷Rg1浓度增高表现为先升后降。10μmol/L人参皂苷Rg1组的MTT吸光值最大,5～15μmol/L范围内各组的MTT吸光值均显著高于对照组,20μmol/L浓度组与对照组之间的吸光值差异无显著性意义。集落形成实验显示,5～20μmol/L人参皂苷Rg1各组的EPC集落生成能力都显著高于对照组;10μmol/L组的集落生成率最高,显著高于其它各组。10μmol/L人参皂苷Rg1组的细胞增殖指数显著高于对照组。4.RNA-seq数据显示,与对照组相比,3个人参皂苷Rg1处理组都有许多基因显著差异表达。DEGs功能富集分析表明,DEGs主要与细胞通讯、分子功能调控、发育过程、细胞膜受体、细胞外基质、离子转运等相关,涉及的主要信号通路包括细胞周期、PI3K-Akt、Wnt、MAPK、雌激素、细胞分化等通路。RT-q PCR结果表明,Celsr3、Mapk4、Col3a1、Nos3、Mmp9、Cdkl3、Notch1、Grk4、Bnip3、Mapk7、Mapk11、Mapk8、Stat5a、Gper1、Bnip1、Cdk20基因的表达显著上调,显著下调P21、Casp12、Casp4、Casp6的表达显著下调,支持RNA-seq的结果,这些基因与细胞凋亡和增殖调控等功能密切相关。蛋白互作网络分析显示,Cdc20、CDK4、CDK6、P21、Bub1b等差异基因编码的蛋白处于一些信号转导网络中的重要位置,这些网络主要与细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡、细胞分化及癌症等相关。结论1.采用细胞克隆选择和长期自然传代培养相结合,首次成功建立小鼠骨髓内皮祖细胞系MBMME2。2.在体外培养条件下,人参皂苷Rg1能促进小鼠骨髓内皮祖细胞传代细胞及其细胞系细胞的增殖,并呈明显的浓度依赖性;浓度过高时,其促增殖作用减弱。3.转录组研究揭示,人参皂苷Rg1对MBMME2细胞体外生长的影响机制涉及许多基因表达的上调和下调,这些基因主要参与Jak-Stat、MAPK、Wnt、PI3K-Akt、细胞分化及雌激素等信号通路。