柑橘红肉突变体因其果肉富含高营养价值的番茄红素以及鲜艳的色泽而具有广阔的市场竞争力。这些突变体不仅为研究类胡萝卜素代谢,也为研究类胡萝卜素下游产物如ABA,维生素A的生物合成提供了极佳的材料。其中,红肉脐橙是目前世界上维数不多果肉呈粉红色的甜橙品种；红暗柳甜橙是新发现的一个甜橙红肉突变体。本研究主要包括四部分内容：从红肉脐橙果肉cDNA文库EST序列入手,分析其果实发育过程中基因组成和表达情况,并利用数字化表达分析鉴定红肉脐橙和其野生型华盛顿脐橙果实中的差异表达基因；对3个果实丰富表达基因metallothionein(MT)的分类、基因结构、表达模式以及抗氧化功能进行分析；克隆红肉脐橙果实中ABA合成和分解相关基因；以甜橙红肉突变体红肉脐橙、红暗柳甜橙及其各自野生型纽荷尔脐橙、暗柳甜橙为材料,分析果实发育过程中ABA含量变化趋势及ABA代谢相关基因的表达。主要研究结果如下：1红肉脐橙果实EST分析(1)从红肉脐橙cDNA文库中随机挑选克隆测序,获得EST序列1540条,通过序列前处理、拼接、注释以及对文库的基因构成分析,发现逆境相关基因如金属硫蛋白3(6.0%),热激蛋白(1.7%),Cu/Zn过氧化物歧化酶(0.6%),晚期胚胎丰富蛋白(0.5%)等均在红肉脐橙果实发育过程中大量表达。(2)预测了文库中EST序列的SSR和SNP位点。SSR位点中以三核苷酸重复(40.9%)居多,挑选部分EST-SSR标记对16个柑橘品种进行了多态性检测,46对引物中共筛选到21对有多态性的引物；SNP分析发现置换的出现频率(73%)显著高于颠换(27%),与华盛顿果实contigs比较分析共产生了404个SNP位点,其中387个为杂合位点,17个为品种特异性位点。(3)下载华盛顿脐橙果实不同发育时期和部位EST序列12658条,对红肉脐橙和华盛顿脐橙果实中的基因表达水平进行预测,鉴定了133个在品种间差异表达的基因。它们主要参与了代谢、细胞防御、信号转导、光合、运输等生物过程,其中包括MYB、MYC、bHLH、NAC、bZIP等转录因子。用实时荧光定量PCR对其中8个差异基因进行了表达验证,表达结果与预测基本一致,编码过氧化氢酶、乙醛脱氢酶的基因在红肉脐橙中表达增强,而LEA5基因的表达低于普通脐橙。2果实丰富表达基因MT相关分析在红肉脐橙和华盛顿脐橙果实EST分析过程中,发现了3个在柑橘果实中高丰度表达的金属硫蛋白(Metallothionein, MT),它们分属于type 1, type 2, type 3 MT蛋白。CsMT-1为柑橘中一个新鉴定的MT基因,以单拷贝存在柑橘的基因组中,仅编码63个氨基酸,含有2个外显子和3个内含子,启动子区域包含很多光调控元件以及与组织特异性表达相关的元件,但并未发现一般植物MT基因启动子所包含的金属反应元件MRE以及乙烯响应相关元件ERE。3个CsMT基因具有不同的组织器官优先表达特性,在纽荷尔脐橙果实中的表达量高于红肉脐橙,且表达均受低浓度ABA的诱导。体外活性实验表明,3种CsMT蛋白均能不同程度地修复DNA氧化性损伤,对植物体起保护作用。3红肉脐橙ABA代谢相关基因的克隆及分析(1)ABA合成相关基因的克隆与分析。红肉脐橙中CsZEP基因存在内含子保留形式的选择性剪切现象,共产生了4个转录本,其中3个均发生提前终止从而缺失ZEP部分功能结构域；Southern杂交预测该基因在基因组中可能以一个或两个拷贝的形式存在；4个转录本分别构建了原核表达载体,并在细菌中开展了功能互补实验。同时,从红肉脐橙果实中分离了参与ABA生物合成的其他结构基因CsVDE (GenBank accession no. HM036682), CsABA4 (HM036683), CsABA2(HM036684), CsAAO3 (HM036685)和CsABA3 (HM036685)的全长或部分序列。(2)ABA分解代谢相关基因的克隆与分析。红肉脐橙果实中含有4个编码ABA8’-羟化酶的CYP707A基因,它们分别编码477,477,471和470个氨基酸。CsCYP707As表达水平存在明显的组织差异,在果实发育过程中的表达受内源ABA调控,同时,外源ABA处理对其表达也具有诱导作用。同时,从红肉脐橙果实中分离了编码ABA葡萄糖基转移酶的CsAOG基因,其序列全长1464 bp,编码481 aa。4红肉突变体果实中ABA积累特性分析(1)测定了暗柳甜橙、纽荷尔脐橙以及各自的红肉突变体红暗柳甜橙、红肉脐橙汁胞中的ABA含量,结果表明,各品种汁胞的ABA变化动态基本保持一致,均在果实发育过程中出现了两次ABA积累高峰,第一次高峰均发生在150DAFB时,第二次高峰出现在果实发育后期(210 DAFB或240 DAFB);红肉突变体汁胞中ABA含量均显著低于同时期野生型汁胞中的含量。(2)测定了红肉突变体和野生型成熟汁胞中的类胡萝卜素含量。红肉突变体中类胡萝卜素含量显著高于普通品种(4-50倍),不仅番茄红素大量积累,番茄红素上游代谢产物如八氢番茄红素以及下游产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素含量和ABA前体9-顺式-紫黄质均大幅度增加,这说明甜橙红肉突变体中ABA含量的减少不是底物不足造成的。(3)红暗柳甜橙和暗柳甜橙汁胞中ABA合成相关基因的表达分析。各基因在两个品种果实发育过程中的表达变化与ABA积累量基本保持一致；CsNCED2, CsNCED3在红暗柳中下调表达,而其他结构基因CsZEP, CsVDE, CsABA4, CsABA2, CsAAO3和CsABA3在红暗柳中的表达量偏高,说明CsNCEDs基因下调表达是红暗柳甜橙ABA表型形成的主要调控因素。此外,本实验4个甜橙品种的CsNCEDs基因序列(编码区和启动子区)完全相同,表明红肉突变体和野生型间CsNCEDs的差异表达并不是序列差异引起的,而可能来源于调控其表达的转录因子的变化。(4)红暗柳甜橙和暗柳甜橙汁胞中ABA分解相关基因的表达分析。除150DAFB外,其他发育阶段4个CsCYP707A基因和CsAOG基因在红暗柳甜橙中的表达均强于暗柳甜橙,说明红暗柳中ABA分解加快也是其ABA含量偏低的一个重要原因。综上所述,与普通甜橙相比,甜橙红肉突变体表现出了温和的ABA缺陷型表型,该表型的产生是生物合成过程中CsNCEDs下调表达以及分解代谢中CsCYP707As和CsAOG上调表达共同作用的结果。最后,围绕ABA与类胡萝卜素之间可能的交互作用展开了讨论。