脑血管病(脑卒中)是危害人类健康的常见病,具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点,目前是世界第三大死因。在中低收入国家,脑卒中死亡率尤为严重(占全球死亡的85.5%),因脑卒中所导致伤残而损失的调整寿命年(QALYs)是高收入国家的7倍,寻找有效的治疗手段并阐释其机理是目前脑科学领域的研究热点。研究证实,脑缺血损伤后缺血中心区的神经元死亡以坏死为主,而缺血周边半暗带区的神经元死亡与凋亡有关,如何挽救缺血半暗带区受损的神经细胞是一个值得关注的重要课题,因此研究引起细胞凋亡的信号转导机制可能为脑缺血提供新的前景。JAK-STAT系统是脑缺血后的炎性反应中重要的信号转导通路,也是决定病灶区细胞凋亡进程的重要因素。JAKs激酶作为JAK-STAT信号转导系统的重要组成部分,是许多细胞因子、生长因子的重要信号传感器。众所周知,针刺对脑缺血性疾病有着独特的疗效,具有多环节、多层次、多靶点的作用特点,而针刺对脑缺血后JAKs激酶作用机制研究尚未明确。因此,本文拟从JAKs激酶及其下游因子STATs与神经细胞凋亡间的关系及电针对其影响作用进行研究,以进一步揭示针刺治疗缺血性中风的作用机制,为临床治疗提供坚实的研究基础。本文分为文献研究、实验研究及小结三大部分。1.文献研究综观历代医学典籍,不乏有对中风病的精辟论述。在中风的病因病机认识上,经历了外风论、内风论以及非风论等阶段。归纳起来不外乎风、火、痰、气、虚、瘀六端,此六端常相互影响,相互作用,合而为病。为探讨古代针灸文献中针灸治疗中风病的选穴规律,本文选取晋代至清代具代表性的12部医著文献,通过确立中风检索词、建立数据库、频数分析及支持度对比的方法,总结出中风病总体腧穴运用频次,半身不遂、口眼歪斜、语言不利三大症状腧穴运用频次及经络腧穴相关性。现代文献研究方面,本文就缺血性中风的病理生理学机制、针灸作用机理、JAKs激酶及JAK-STAT信号转导通路与脑缺血发病机制的研究进展进行了综述,认为脑缺血能引起JAKs激酶的异常活化,但该信号途径的异常活化与缺血导致的神经元存亡之间的具体关系尚不十分清楚。因此进一步探讨JAKs激酶及JAK-STAT信号转导途经在缺血性脑损伤中的调控机制及针刺干预作用,将为防治缺血性脑损伤提供有益的线索。2.实验研究目的：观察电针对局灶性脑缺血大鼠缺血灶周围区不同时间段缺血侧皮质神经元病理形态学、神经元细胞凋亡、酪氨酸蛋白激酶JAKs及其下游因子STATs的影响,进一步揭示针刺治疗脑缺血疾病的可能作用机理。方法：SPF级雄性SD大鼠300只,按随机区组化法分为5组：假手术组、模型组、电针组、AG490组、电针+AG490组,各组又分为术后2h、1d、3d、7d、21d5个不同时段亚组。假手术组只暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭；模型组采用电凝闭大脑中动脉建立局灶性脑缺血模型；电针组手术凝闭大脑中动脉,予电针治疗；AG490组侧脑室注射AG49020min后,手术凝闭大脑中动脉；电针+AG490组侧脑室注射AG49020min后,手术凝闭大脑中动脉,续予电针治疗。观察指标如下：(1)各组大鼠神经功能缺损评分、HE染色及透射电镜观察局灶性脑缺血大鼠大脑皮质缺血灶周围区病理形态学改变。(2)TUNEL细胞凋亡染色法观察不同时段各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区神经元细胞凋亡情况。(3)采用免疫荧光染色法、Western Blot、原位杂交法检测各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区JAK1磷酸化蛋白及mRNA表达变化。(4)采用免疫荧光染色法、Western Blot、原位杂交法检测各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区JAK2磷酸化蛋白及mRNA表达变化。(5)免疫荧光染色法和激光共聚焦显微镜观察各组大鼠大脑皮质缺血灶周围区JAK下游因子p-STAT3、p-STAT5表达情况。(6)运用双尾Pearson/Spearman相关检验分别进行2h、1d、3d、7d及21d五个时间段脑缺血模型组p-JAK、p-JAK2、p-STAT3、p-STAT5平均荧光强度值与神经细胞凋亡相关分析。结果：(1)缺血早期大鼠即出现神经功能缺损,神经功能缺损峰值出现在脑缺血后1d,随着缺血时间的延长,其神经行为学评分明显降低,以21d下降最为明显。除21d组,各时段干预组评分与同时段模型组相比,神经功能缺损评分具有所减少(P<0.05)。结合HE染色、电镜观察,其病理形态学改变与神经功能缺损的发展趋势基本一致,说明了电凝闭大脑中动脉致局灶性脑缺血大鼠模型的成功性,同时也说明电针治疗、AG490干预对脑缺血大鼠神经缺损体征具有明显改善作用,对脑缺血后大脑皮质神经元的恢复有一定促进作用。(2) TUNEL细胞凋亡检测结果显示：大鼠脑缺血2h后,在缺血侧大脑皮质可见较多的凋亡细胞,脑缺血1d后凋亡细胞的表达达到峰值,脑缺血3d细胞凋亡阳性反应物仍处较高的表达水平。随着缺血时间的延长,凋亡细胞数目逐渐下降,以脑缺血后21d减少最为明显。电针治疗方面,缺血后各时间段其细胞凋亡表达水平均低于模型组,以1d、3d、7d时间相点比尤为明显(P<0.01)。AG490组大鼠缺血侧脑组织细胞凋亡的变化趋势及其抗凋亡作用与电针组基本一致。电针治疗与AG490干预的协同作用方面,在脑缺血的超早期(2h),两者的联合应用即可较好地抑制细胞凋亡(P<0.05),但是在缺血后1d、3d、7d时间段,电针+AG490与单纯电针治疗或AG490干预相比差异不明显(P>0.05)。(3)采用免疫荧光染色法、western blot、原位杂交技术研究电针对局灶性脑缺血大鼠不同时间段p-JAK2蛋白及mRNA表达的影响。假手术组各相点的只检测到少量p-JAKl表达,脑缺血后2h大鼠缺血侧皮质即可检测到相当数量的JAK1磷酸化表达,缺血后1d达到高峰,模型3d组较前有所下降,随着缺血时间的延长,模型7d组p-JAK1的表达持续下降,直至缺血后21d尚有少量表达。电针组在1d、3d时间段JAK1磷酸化水平明显高于相应相点模型组的表达含量(P<0.01)。(4)假手术组大鼠的皮质中p-JAK2的表达量极少,说明正常生理状态下脑组织中JAK2是以非磷酸化形式存在。模型组2h大鼠缺血侧大脑皮质可检测到少量p-JAK2表达,脑缺血后1d到达峰值,M3d组开始下降,缺血后21d仍可检测到p-JAK2的少量表达。除缺血后2h、21d时间段,电针组JAK2磷酸化水平均少于同时间段模型组,1d、3d组尤为明显(P<0.01)。AG490组对JAK2磷酸化干预作用比电针组更明显,这种优势主要体现在脑缺血神经功能缺损的高峰期,即脑缺血后1d,A1d组与Zld组差异有显著性意义(P<0.05)。电针治疗与AG490干预协同作用方面,脑缺血后2h,两者的联合应用即可较好地抑制JAK2的磷酸化水平(P<0.05),此外,E+A1d与Eld、E+A3d与E3d相比较均有统计学意义(P<0.05),说明二者的共同作用在减少p-JAK2超量表达方面比单纯电针干预更有优势。(5)采用免疫荧光染色法观察电针对局灶性脑缺血大鼠不同时间段p-STAT3、 P-STAT5蛋白表达的影响。结果显示：①脑缺血后1d组的P-STAT3含量升高到达峰值,3d组开始下降,缺血后21d表达量明显减少。P-STAT3免疫阳性细胞的表达与脑缺血后p-JAK2、凋亡细胞的变化规律在时空分布及动态变化上呈一致性,都是在缺血后1d显著升高达到峰值,而其后又随着时间的推移逐渐下降。与模型组相比,脑缺血后1d、3d,电针治疗可明显减少STAT3的磷酸化表达水平。②缺血后2h,模型组即可检测到大量P-STAT5免疫荧光阳性细胞的表达,缺血后1d达到最高值,而缺血后3d,模型组P-STAT5水平开始下降,直到缺血后7d,21d, p-STAT5含量明显降低。在脑缺血1d,即P-STAT5表达的峰值期,电针治疗可促进STAT5的磷酸化；到缺血3d时,电针则明显提高P-STAT5的表达水平(P<0.01)；至脑缺血7d、21d时,电针组与模型组相比,差异虽无统计学意义,但在数据上具有一定优势。(6)脑缺血后JAK/STAT信号转导通路与神经细胞凋亡相关性分析：JAK1、JAK2、STAT3磷酸化表达与神经元细胞凋亡在脑缺血高峰期(即缺血后1d、3d时间段)密切相关,而在脑缺血慢性期关联性不甚明显。此外,p-JAK1蛋白表达与TUNEL细胞凋亡呈负相关性,P-JAK2、 p-STAT3蛋白表达与TUNEL细胞凋亡呈正相关性,P-STAT5蛋白表达与TUNEL细胞凋亡相关性不明显。结论：(1)缺血性脑损伤后,大鼠神经功能缺损、病理形态变化及神经细胞凋亡情况有向好的方向发展趋势,说明脑损伤后具有自我可塑性的调节机能。而电针可以改善受损的神经功能障碍,促进神经元的修复,抑制脑缺血后的神经元细胞凋亡。(2)电针治疗的介入能显著提高脑缺血早期缺血侧皮质JAK1的活性,激发机体自我保护机制,减轻脑缺血损伤,并且能促使这种保护性的效应维持一段较长的时间,参与受损组织的修复。(3)JAK2及其下游因子STAT3磷酸化的超量表达,JAK2-STAT3通路的异常激活与诱导细胞凋亡有关。电针治疗缺血性脑血管疾病的机制可能是通过针刺信号激发躯体神经系统的有关反应来启动相关信号转导通路来调节,即电针通过抑制JAK2-STAT3的异常活化,部分阻断或降低了炎性细胞因子的细胞内信号转导,以减少细胞凋亡的发生。(4)予JAK2阻滞剂AG490干预后,可明显抑制JAK2磷酸化表达和神经元细胞凋亡,且其与电针的协同作用更为明显,提示脑缺血后AG490对缺血灶大脑皮质神经元修复作用可通过作用于JAK/STAT信号转导系统而实现的。(5)电针能提高脑缺血缺血侧皮质STAT5磷酸化表达,作用机理可能是通过激活STAT5所诱导的相关细胞因子通路,以减轻脑缺血的损伤,提高修复受损神经元的能力。(6)结合本研究的实验结果,我们认为针刺启动JAK/STAT信号转导通路,促进神经自稳态调节是其治疗缺血性脑损伤的关键作用机制。