论文部分内容阅读
γ-氨基丁酸(GABA)是一种非蛋白质氨基酸，被广泛用于化工、食品和药品行业。现有γ-氨基丁酸的制备主要有化学法、植物富集法和发酵法。化学法污染大，涉及到有毒有害试剂，不环保;植物富集法得到的γ-氨基丁酸含量较低。所以发酵法制备具有很大的优势，但是现有发酵法制备所用到的谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活较低，导致产物γ-氨基丁酸的产量较低，也增加了后期产品结晶工艺的难度。所以寻找一株高谷氨酸脱羧酶活力的菌株备受关注。 本文从实验室保藏的一株Kodamaea ohmeri NH-9中克隆得到了编码谷氨酸脱羧酶的基因gad，经测序分析，gad序列与来源于Saccharomyces cerevisiae MJ2的核苷酸序列相似度达99.5％。而后实现了gad基因在大肠杆菌中的可溶性表达，获得了一株具有高谷氨酸脱羧酶活力的重组菌E.coli BL21/pET28a-gad。SDS-PAGE检测，该酶的分子量大小约为64.5 kDa。经测定该重组菌发酵液的酶活为38 U/ml，约为原始菌Kodamaea ohmeri NH-9的3倍。 对重组菌的发酵培养基和催化条件进行了优化。实验表明重组菌培养的最适培养基组分为:乳糖10 g/L，L-谷氨酸0.5g/L，酵母粉20 g/L。最佳诱导产酶条件为25℃诱导20-24 h，生物量达到29.86 g/L，酶活力55 U/ml。利用全细胞转化实验确定了L-谷氨酸脱羧制备GABA的最适pH为4.5，最适温度为37℃，最适辅酶为盐酸吡哆醛25μg/L，GABA终浓度高达247g/L，该工艺经济性较好。 开展了GABA分离工艺的研究，转化液中加入0.5％-1％的活性炭（调pH酸性），水浴45-60 min后加入1％硅藻土，搅拌均匀后过滤，达到同时脱色和除菌的目的。对产品结晶工艺进行了研究，建立了乙醇结晶法。乙醇和粗品GABA的用量比为10∶1(w/w)，控制溶解温度为70℃。经过两步降温过程使温度降到0-4℃，保持静置12h，抽滤得晶体后60℃干燥6小时左右，既得GABA成品，成品GABA有较好的光泽，对产品进行红外、质谱和核磁表征，经液相检测，其纯度在99％以上。