目的疏风宣肺方和解表清里方是中日友好医院晁恩祥教授的经验方,经临床实践证实可有效地治疗甲型流感。本研究旨在从基因、mRNA以及蛋白质水平,探讨两种治法抗流感方药对流感病毒性肺炎小鼠肺组织细胞凋亡、炎性细胞因子、基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制剂、自然杀伤细胞(NK细胞)毒性相关信号转导通路差异基因,抗原提呈细胞识别及CD8+T细胞活化、增殖分化信号转导通路,以及TLR3、P38、JNK表达的调控作用,从而明确两种治法方药对流感病毒感染细胞后造成损伤的保护作用。方法与结果实验一流感病毒性肺炎小鼠肺组织炎性细胞因子表达及疏风宣肺方和解表清里方的调控作用方法：制备甲型流感病毒性肺炎小鼠模型,随机分为空白组(N)、肺炎模型组(M)、奥司他韦对照组(C)、疏风宣肺方大、中、小剂量组(Large-dose Shufengxuanfeiformula. Medium-dose Shufengxuanfei formula. Small-dose Shufengxuanfei formula,即SL、SM和SS),解表清里方大、中、小剂量组(Large-dose Jiebiaoqingli formula、Medium-dose Jiebiaoqingliformula、 Small-dose Jiebiaoqingli formula,即JL、JM和JS)。提取总RNA,采用基因芯片Pathway分析,挑选参与调控炎症相关通路中的靶基因。同时,通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)在mRNA表达水平对IL-1β、IL-8、IL-10、RANTES、 ICAM-1的表达进行验证。设计引物序列,使用TRIzol试剂提取肺组织中的RNA后,用引物进行一步法实时荧光定量PCR反应,用相对定量2-△△Ct分析各个样本目的基因的表达。蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测IL-1β蛋白的表达,应用Image-Pro Plus软件对扫描图像的目的条带进行吸光度分析,各目的条带与GAPDH的吸光度比值为目的蛋白的相对表达量。结果：模型组差异表达基因IL-1β、CXCR-2、CCL-5、IL-10、IL-6、IL-18、 TGF-β1、CCL-2明显上调,较空白组差异显著。两方药大、中、小剂量组对IL-1β、CXCR-2、IL-10、IL-6表达有显著的下调作用,SM及SS组下调IL-18、TGF-β1、CCL-2、CCL-5基因的表达,JM及JL组下调差异表达基因IL-18、CCL-5。 qRT-PCR和Western blotting法结果显示,两种方药大、中、小剂量组均可降低mRNA与蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。SM组和JM组对IL-8、IL-10、 RANTES、ICAM-1的mRNA有显著抑制作用(P<0.05或P<0.01)。qRT-PCR结果与基因芯片结果基本一致。实验二不同治法方药对流感病毒性肺炎小鼠MMPs和TIMPs表达影响的研究方法：动物分组、造模、给药方式同上。提取总RNA,采用基因芯片筛选,在炎性细胞穿越内皮细胞迁移通路中涉及MMPs和TIMPs的差异表达基因；荧光定量PCR对MMP-1和MMP-9基因进行验证。结果：模型组差异表达基因MMP9、TIMPl、MMP3、MMPl4、MMP19明显上调及MMP-2、TIMP2明显下调。治疗组疏风宣肺方中小剂量和解表清里方中剂量对MMP9、TIMP1、MMP3、MMP14、MMP19基因表达具有显著的下调作用,显著上调TIMP-2、MMP-2的基因表达；荧光定量PCR结果显示,疏风宣肺方中小剂量与解表清里方中剂量对MMP-9、MMP-1表达有显著抑制(P<0.01)。实验三疏风宣肺方和解表清里方干预流感病毒性肺炎小鼠细胞凋亡的研究方法：动物分组、造模、给药方式同上。提取各组总RNA,采用基因组芯片筛选出与凋亡密切相关的差异表达基因,并用荧光定量PCR对部分基因Caspse-3、Caspase-8和Caspase-9进行验证结果：模型组差异表达基因Casp3、Casp8、Casp9、Fas、FasL、Tnf、 Tnfrasfla、Tradd、Il1a、Il1b、Il1r1、Illr2、Casp7明显上调,较空白组差异显著。疏风宣肺中剂量组对差异表达基因Casp8、Casp7、Fas、Tnf、Tradd、 Il1a、Il1b、Il1rl、Il1r2明显下调。SL组下调上述基因的作用优于JL组,SM组下调上述基因的作用优于JM组。荧光定量PCR结果显示,SL组与JM组对天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白-3、-8、-9(Caspase-3、-8、-9)表达有显著抑制作用(P<0.01)。实验四流感病毒性肺炎小鼠自然杀伤细胞毒性相关信号转导通路差异基因表达及两种不同治法方药的调控作用研究方法：动物分组、造模、给药方式同上。提取各组小鼠肺组织总RNA,采用基因组芯片筛选出NK细胞毒性信号转导通路相关的差异表达基因,以Ⅰ表示信号强度；并采用荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)对部分基因TNF-α进行验证。结果：在NK细胞毒性相关信号传导通路中,M组较N组上调差异基因42个；用药治疗后,SM组下调差异表达基因36个,JM组下调差异表达基因为29个,SL组下调差异表达基因为22个,JH组下调差异表达基因为21个,SH组差异表达基因为20个,SH、SL、JH、JM组表达下调的基因均包括在SM组的表达谱中,表明SM组调控NK细胞毒性作用基因作用最显著。qRT-PCR和Western blotting测定结果显示,与模型组比较,疏风宣肺方与解表清里方大、中、小剂量组对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA及蛋白表达均有显著抑制作用,疏风宣肺方以中剂量组为优(中剂量组TNF-α mRNA:1.07±0.19比3.20±0.56均<0.01),解表清里方以中剂量组为最低(TNF-α mRNA:1.19±0.14比3.20±0.56均<0.01)。实验五疏风宣肺方及解表清里方对流感病毒性肺炎小鼠肺组织中TLR3、 P38、JNK表达影响的研究方法：动物分组、造模、给药方式同上。提取总RNA,采用基因芯片Pathway分析,挑选参与MAPK信号传导通路相关的靶基因。同时,通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)在mRNA和蛋白表达水平对TLR3、P38、JNK的表达进行验证。结果：模型组差异表达基因Tlr3、Mapk8、Mapk13明显上调,较空白组差异显著。疏风宣肺方中小剂量和解表清里中剂量组对差异表达基因Tlr3、 Mapk8、Mapk13表达有显著的下调作用。qRT-PCR和Western blotting法结果显示,肺炎模型组TLR3、JNK、P38的mRNA和蛋白表达较空白组显著升高(P<0.05或P<0.01)。SM、SS组和JM组对TLR3、JNK、P38的mRNA和蛋白有显著抑制(P<0.05或P<0.01)。且疏风宣肺方的治疗作用表现为剂量越小,疗效越好。该结果和基因芯片表达的结果相符。实验六疏风宣肺方对FM1感染小鼠CD8+T细胞活化功能的影响的研究方法：动物分组、造模、给药方式同上。提取总RNA,采用基因芯片Pathway分析,基因芯片数据分析抗原提呈细胞识别及CD8+T细胞活化、增殖分化信号转导通路相关差异表达基因。结果：与空白组比较,模型组肺组织中差异表达基因Tap1、Tap2、Hspa5、 Hspala、Hspalb、H2-M2、H2-M3、H2-Q10、Lta、Psme1、H2-T24、Psme2、Cd8a、 Cd8bl、Cd3g、Cd247、Ptprc、Zap70、Ctla4均明显上调。与模型组比较,疏风宣肺方上述差异表达基因(除Hspa5、Cd3g之外)均有所下调,且疏风宣肺方中剂量组下调上述基因的作用强于疏风宣肺方高、低剂量组。结论1.疏风宣肺方和解表清里方能调节甲型流感病毒性肺炎小鼠IL-1β、 IL-8、IL-10、RANTES、ICAM-1的mRNA、MMPs和TIMPs表达,能抑制流感病毒感染后的肺组织炎症损伤。2.疏风宣肺方和解表清里方通过抑制以TLR3介导MAPK信号通路中JNK和P38过度活化来拮抗肺组织炎症损伤,同时也通过调控甲型流感病毒性肺炎小鼠Caspase-3、-8、-9表达,对抗流感病毒感染后的细胞凋亡,从而发挥抗病毒作用。3.流感病毒感染后在宿主细胞内增殖即成为带有病毒抗原的靶细胞,并激活NK细胞毒性信号转导通路的相关基因表达增加,被NK细胞识别并杀伤；同时,通过抗原提呈细胞识别,并摄入和提呈靶抗原(即流感病毒感染细胞)给初始CD8+T淋巴细胞,使其分化为CTL细胞,可杀伤靶细胞,发挥细胞免疫作用,从而与NK细胞发挥协同作用。两种方药均可下调NK、CTL细胞中表达上调的差异基因,其下调机制与两种方药能明确减少流感病毒性肺炎体内靶抗原、减弱NK细胞识别活化作用以及T细胞活化增殖为CTL降低,恢复宿主免疫平衡有关。