颞颌关节（temporomandibular joint，TMJ）是人体中最精细、也是承力最频繁的关节之一。相应地，在分散咀嚼压力过程中发挥重要作用的髁突软骨即成为关节系统中与力学刺激最密切的结构之一。临床上，由于炎症、肿瘤、外伤和发育异常等多种原因造成的髁突软骨缺损或退行性病变很常见，而寻找软骨缺损修复的方法一直是临床的难题。在传统的关节软骨钻孔、自体软骨膜、骨膜移植和自体的骨软骨移植都没有取得良好效果的情况下，组织工程为关节软骨损伤的修复带来了新的希望。骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）是目前软骨组织工程最理想的种子细胞。虽然针对大关节透明软骨的大量实验都证明了BMSCs体外诱导性培养和体内关节软骨的修复均能有效地生成软骨，但就目前的研究现状来看，软骨组织工程修复法并不十分完善，还存一些问题需要解决：在种子细胞方面，BMSCs作为软骨组织工程的种子细胞，常规的细胞悬液的接种方式存在接种效率低、细胞容易流失等缺点，需要进一步改进；支架材料方面：目前应用于软骨组织工程的主要支架材料仍存在生物相容性较差，力学性能不足的缺点；生长因子方面则存在纯化的生长因子价格昂贵、难以获得以及外源性的生长因子常引起免疫排斥反应等问题。相关研究已表明，细胞膜片技术与富血小板纤维蛋白（platelet-richfibrin，PRF）的出现可以有效解决上述问题，并且二者在修复关节软骨缺损方面都有着很好的应用前景。然而，可否将二者复合而成的双膜复合体作为组织工程移植物植入到缺损区用于关节软骨缺损的修复尚需进一步研究。到目前为止，组织工程软骨尚止于组织形态及生化成分上与天然软骨的类似，而还难以实现与原有软骨相同的功能性再生。要成功获得关节软骨的再生修复，还需对种子细胞的生长微环境进行合理的体外模拟和体内控制是目前软骨组织工程研究领域的共识。有研究指出干细胞在体内生长的微环境是由包括细胞外基质、细胞因子在内的基质微环境和复杂的力学微环境共同组成的。还有研究报道干细胞比成体细胞有着更强的力学敏感性、生物力学信号对于调节干细胞的表型分化十分重要。那么，力学刺激是否就是软骨细胞表型分化和维持的关键外部刺激信号呢？力学环境的调控是否能有效地改变BMSCs修复软骨缺损的效果呢？虽然目前有零星报道研究了单层BMSCs在力学信号刺激下的生物效应以及信号机制，但由于这些细胞力学模型中的BMSCs都缺乏基质保护、细胞因子支持、甚至力学刺激与细胞因子的“对话”，而且所施加力学刺激条件与真实关节软骨在体的承力状况也相差较大，其研究结果并不能很好地模拟和诠释在体功能状态下BMSCs用于髁突软骨再生时的生物学特点和信号机理。因此本研究拟以采用膜片化的BMSCs，复合富含多种内源性生长因子的PRF，构建BMSCs/PRF双膜复合体的基质复合体以模拟关节软骨在体基质微环境；并将BMSCs/PRF双膜复合体经体外压力微环境预调后，与软骨碎块混合用于裸鼠皮下移植以观察其异位成软骨能力、在兔髁突软骨缺损区移植以确定其对缺损关节软骨的原位在体修复情况，从而揭示压力调控是否可为组织工程关节软骨的体内外构建与功能性再生提供新的思路、为髁突软骨缺损性疾病的治疗提供新的契机，乃至为多种关节软骨缺损的体外组织工程设计提供研究经验。课题主要分为以下三部分：一、兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及鉴定目的：利用密度梯度离心法联合贴壁筛选法分离、培养及纯化兔BMSCs，并对培养的BMSCs进行鉴定。方法：骨髓穿刺法抽取新西兰兔股骨骨髓3ml，采用密度梯度离心法分离BMSCs并进行体外扩增培养；再对培养至第三代的BMSCs进行成骨、成脂能力观察，以及细胞表面标志物的鉴定。结果：培养的兔BMSCs可在体外迅速扩增，其形态特征与生长规律符合典型BMSCs的特点；可成功向成骨细胞、脂肪细胞方向分化；细胞表面标志物CD29、CD44呈阳性表达，CD34、CD45呈阴性表达。结论：在体外采用密度梯度离心法联合贴壁培养法可成功获得高纯度、具有多向分化潜能的兔BMSCs。二、压力调控BMSCs/PRF双膜复合体异位成软骨的实验研究目的：观察经压力调控后的BMSCs/PRF双膜复合体在软骨微环境下异位成软骨的情况。方法：抽取兔耳中央动脉血制备PRF后，按照本课题组前期探索并已申请的国家发明专利：一种干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜复合体移植材料的制备方法，将自体BMSCs膜片与自体PRF复合形成BMSCs/PRF双膜复合体，再根据本课题组前期筛选出的对体外培养BMSCs/PRF双膜复合体产生良好促软骨向分化效应的生物力学刺激条件：120KPa每天1h、连续4天静态液压进行加载。45只4周龄BALB/C裸鼠随机分为3组（n=15）：单独细胞膜片组（A组）在背部两侧植入BMSCs膜片片段与兔耳软骨碎块的复合物；双膜复合体组（B组）背部两侧植入BMSCs/PRF双膜复合体与软骨碎块的复合物；双膜复合体加压组（C组）则植入120KPa每天1h、连续4天压力刺激预调的BMSCs/PRF双膜复合体与软骨碎块的复合物。分别于术后2、4、8周取材，进行HE与甲苯胺蓝染色观察，并运用IPP6.0软件对各组甲苯胺蓝染色图片进行着色强度分析，所得结果用SPSS13.0软件统计处理。结果：HE染色显示，B组与C组2、4、8周均可见软骨细胞生成，并且C组在各时间点软骨细胞生成量要多于同时间点的其它组；甲苯胺蓝染色显示，B组与C组2、4、8周平均OD值呈逐渐增加趋势，并显著高于同时间点的A组（P<0.05），而且C组在4周与8周平均OD值显著高于同时间点的B组（P<0.05）。结论：经压力调控后的BMSCs/PPF双膜复合体与未经压力预调的双膜复合体相比，在软骨微环境中具有更强的成软骨能力；而没有PRF生长因子微环境支持且缺乏生物力学预调的单纯BMSCs膜片即便在软骨微环境中，其成软骨能力远不及上述两组。三、压力调控BMSCs/PRF双膜复合体修复兔髁突软骨缺损的实验研究目的：探讨经压力调控后的BMSCs/PRF双膜复合体修复兔髁突软骨缺损的可行性。方法：制备自体来源的BMSCs/PRF双膜复合体，其中BMSCs经BrdU预先标记。以120KPa每天1h、连续4天静态液压加载。取3-4月龄新西兰兔45只，随机分为5组（n=9），首先建立兔双侧髁突软骨缺损的模型，再分别进行以下处理：空白对照组（A组）缺损区不作任何处理；单独PRF组（B组）在缺损区植入自体PRF膜片颗粒；单独细胞膜片组（C组）缺损区植入自体BMSCs膜片片段；双膜复合体组（D组）缺损区植入自体BMSCs/PRF双膜复合体；双膜复合体加压组（E组）在缺损区植入压力处理过的自体BMSCs/PRF双膜复合体。分别于术后2、4、8周取材，进行大体观察与HE、甲苯胺蓝染色以及BrdU免疫组化染色，并运用IPP6.0软件对各组甲苯胺蓝染色图片进行着色强度分析，所得结果用SPSS13.0软件统计处理。结果：大体形态学观察，采用120KPa每天1h、连续4天静态液压预调的BMSCs/PRF修复组（E组）在各个时间点修复情况要明显好于同时间点的其它组，8周时该组的髁突软骨缺损区已被完全修复，修复组织色泽、质地与正常软骨基本一致，与周围软骨界线不清。HE染色也证实该组在各个时间点的修复效果都是四种处理中最好的，8周时损伤区已基本被修复，修复组织表层为较致密的纤维组织，较正常纤维层稍厚，其下方软骨层层次清晰，与邻近正常软骨的各层基本连续。甲苯胺蓝染色显示，除空白对照组（A组）外，其余四组的甲苯胺蓝染色强度在2、4、8周随时间延长均呈逐渐增加趋势，以E组8周时的平均OD值最高（P<0.05）。BrdU染色结果证实，修复组织主要来源于术中植入的BMSCs；且在同一时间点，D组和E组新生软骨组织中阳性细胞数要多于C组。结论：经120KPa每天1h、连续4天静态液压预调后的BMSCs/PRF双膜复合体可成功修复兔TMJ髁突软骨缺损。小结：本课题首次采用BMSCs膜片复合PRF膜的双膜复合体，构建用于髁突软骨缺损修复的组织工程移植物。并采用可控细胞液压加载系统模拟TMJ髁突软骨所处的力学微环境，根据前期研究中所筛选的对BMSCs/PRF双膜复合体最适的压力条件，对BMSCs/PRF双膜复合体进行压力微环境预调，进一步探究生物力学微环境对组织工程软骨形成质与量的影响以及对兔髁突软骨缺损的修复效果。研究证实，PRF缓慢释放的大量生长因子可对BMSCs起到相对长效的诱导作用，压力刺激可与PRF相协同共同促进BMSCs增殖与成软骨方向分化。经120KPa每天1h、连续4天压力预调的BMSCs/PRF双膜复合体，在软骨微环境中具有良好的成软骨能力，且可成功修复兔TMJ髁突软骨的缺损。该结果为TMJ髁突软骨再生的力学微环境调控及其在临床的应用提供了重要实验依据。