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桑科植物在全世界范围内共有37个属1100个物种,其中人们熟知的有桑树,面包树,见血封喉等。桑叶是桑属植物桑(Morus albaL.)的叶片,是家蚕的主要食物来源。除此之外,桑的叶、果实和根皮都是常用中药,在降血糖、滋补、治疗外感风热、咳嗽咳喘方面疗效显著。研究组前期研究发现光酶诱导后桑叶中的 moracinC,moracinN,morachalcone,guangsangonE 和 chalcomoracin 含量显著增加:其中chalcomoracin桑树特有的一类Diels-Alder型加合物,在桑树根皮中微量存在,偶尔在桑叶中分离得到,具有显著的抗氧化、抗病毒、抑菌、抗肿瘤和降血糖生物活性。Chalcomoracin结构复杂,有三个手性中心,化学合成得率很低,虽然光酶诱导后的桑叶中chalcomoracin含量显著提高,但桑叶所含化合物成分复杂,叶绿素干扰严重,提取分离成本较高。Diels-Alderase是存在于桑叶中,以moracin C和morachalcone为底物催化合成chalcomoracin的重要酶,本论文以Diels-Alderase的比活力和SDS-PAGE蛋白条带为纯化标准进行检测,对光酶诱导桑叶中chalcomoracin生物合成过程中关键的Diels-Alderase进行分离纯化。本论文的研究结果如下:(1)Diels-Alderase分离纯化的研究。光酶诱导桑叶与100mMpH=7.5的PBS缓冲液按照料液比1:10的比例混合,破碎后并于4℃浸提2h,12000g4℃离心20 min,取上清经硫酸铵分级沉淀收集40-60%组分的蛋白,沉淀用含有0.8 M硫酸铵的pH=7.5的PBS缓冲液复溶。通过疏水层析分离;收集30-50%组分;10 kDa Centrifugal Filter Units 于 4500 g 4 ℃ 离心 20 min 超滤置换缓冲液,过阴离子交换层析;取第4管组分超滤浓缩置换缓冲液,过阳离子交换层析;取流穿组分过凝胶过滤层析。纯化倍数增加,比活力显著增加,回收率下降明显,凝胶过滤层析后蛋白纯化倍数达25.29倍,蛋白回收率仅为0.04%。获得的高纯度蛋白为目标蛋白的解析奠定了基础。(2)光酶诱导桑叶中Diels-Alderase的鉴定及克隆表达研究。基于LC-MS/MS的Diels-Alderase肽段序列鉴定,共得到27个候选蛋白。通过对蛋白条带的MALDI-TOF/TOF鉴定,比对桑叶转录组数据库,最终发现具有Diels-Alderase催化功能的蛋白可能为 chloroplastsedoheptulose-l,7-bisphosphatase(SBPase:景天庚1,7-二磷酸酶)。SBPase开放阅读框长度为1179bp,含有392个氨基酸,预测分子量大小为42521.55Da,等电点为5.96。应用pET-19b载体,对SBPase进行克隆表达,表达菌株为BL21;SDS-PAGE结果表明在37 ℃,1 mMIPTG诱导4h时,有大量可溶性重组蛋白的表达。对重组蛋白进行活性验证显示:在FAD存在条件下,重组蛋白可非高效催化moracin C和morachalcone生成chalcomoracin。本论文从光酶诱导桑叶中分离出电泳纯的Diels-Alderase,经MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS鉴定分析得到候选蛋白的氨基酸序列。并应用原核表达系统对疑似目标蛋白进行体外表达,并进行了活性验证。确定了桑叶Diels-Alderase的筛选范围,为chalcomoracin生物合成途径的研究和chalcomoracin生物合成途径中关键酶Diels-Alderase的结构生物学研究奠定基础。