背景食管癌(esophageal cancer,EC)是世界范围内第11大最常见的恶性肿瘤,居恶性肿瘤死因第6位。其中食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是我国最常见的食管癌类型,居恶性肿瘤死因第4位。随着社会经济地位,生活方式和医疗水平的提高,我国食管癌的发病率和死亡率呈现逐年下降的趋势,但患者的5年生存率仍然很低,目前仍是治疗的难点。因此加深对食管恶性肿瘤的认知显得尤为重要。肿瘤的发生是一个多因素多步骤的过程,目前多种癌基因及抑癌基因的发现和提出部分阐明了肿瘤的发生机制,并且这些研究结果将有望成为肿瘤治疗的新方向。MYBL2基因,又称B-myb,是转录因子MYB家族成员之一,是介导细胞周期进程、细胞存活和分化的重要的调控因子。肿瘤细胞具有无限增殖、抗凋亡、去分化、浸润转移以及治疗抵抗的特点,肿瘤细胞的这些特征促进了其恶性表型的形成并且影响病人的预后。越来越多的证据表明,肿瘤细胞中MYBL2的异常表达参与肿瘤细胞恶性表型的形成及影响肿瘤患者的预后。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得侵袭、迁移和抗凋亡能力的重要生物学进程。近期研究表明MYBL2参与肿瘤EMT的发生。微小RNA(microRNA,miRNA)是在动植物中广泛表达的一类非编码单链小分子RNA,包含18-24个核苷酸,通过与靶基因mRNA上特定的碱基序列结合而影响的转录与稳定。miRNA对细胞的增殖、分化和凋亡有重要的调节作用。既往研究表明,miRNA与包括食管鳞癌在内的恶性肿瘤的发生及发展过程密切相关,MYBL2的表达在转录后水平也可以受到多种miRNA的调控。而在食管鳞癌中miRNA对MYBL2的调控机制的研究较少,探究食管鳞癌中MYBL2表达失调的机制也可为食管鳞癌的致癌机制提供一定的理论支持。目前,关于MYBL2在食管鳞癌中的研究报道较少,主要缺乏MYBL2在食管鳞癌中致癌作用及机制研究。其中,MYBL2是否参与食管鳞癌EMT进程,食管鳞癌中MYBL2的表达失调是否与miR-29c-3p有关等问题都尚未见报道。为了解决这些问题,本研究首先探讨了MYBL2在食管鳞癌中的表达及与临床病理特征和预后的关系;探讨MYBL2在食管鳞癌细胞增殖方面的作用机制,以及探讨MYBL2是否参与食管鳞癌的EMT及迁移侵袭过程;本研究还进一步探讨了MYBL2在食管鳞癌中表达异常的上游调控机制。本论文将分成五个部分进行阐述:第一部分基于高通量多组学数据分析MYBL2基因在食管癌中的表达及临床意义目的基于高通量数据库分析MYBL2基因在食管癌中的表达及临床意义。方法1.采用TCGA数据库和基因表达数据库(GEO)的门户网站(cBioPortal和Oncomine)以及癌症多组学及临床数据库Linked Omics分析MYBL2 mRNA在食管癌中的表达变化及其与临床预后的关系。2.采用Kaplan-Meier法分析MYBL2基因改变与食管癌患者生存期的关系,非参数检验分析食管癌癌组织与正常食管组织中MYBL2 mRNA的表达差异,Spearman非参数检验分析食管癌中MYBL2 mRNA 水平与临床各指标的相关性。结果1.cBioPortal分析结果显示185例食管癌病例中,19.5%(36例/185例)病例发生了MYBL2基因的改变,其中主要以基因扩增以及mRNA上调为主。MYBL2基因发生改变的患者(基因扩增以及mRNA上调)较MYBL2无改变的患者具有较低的无病生存期及总体生存期,但差异尚不具有统计学意义(P=0.179;P=0.273)。2.Oncomine分析结果显示,食管鳞癌及食管腺癌组织中MYBL2 mRNA水平均明显高于癌旁正常组织(P<0.00l;P<0.001)。3.Linked Omics分析结果显示,发生远处转移的食替管癌病例MYBL2 mRNA的表达水平明显高于无远处转移病例(P<0.01);而且,MYBL2 mRNA的表达还受到患者年龄的影响(P<0.01),年龄越小的病例MYBL2 mRNA的表达水平更高。第二部分MYBL2蛋白在食管鳞癌中的表达以及与临床病理特征和预后的关系目的检测MYBL2蛋白在食管鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,探讨MYBL2蛋白水平与食管鳞癌患者临床病理特征及预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测107例食管鳞癌组织及癌旁正常组织中MYBL2蛋白的表达情况;用卡方检验分析MYBL2蛋白与临床病理特征之间的关系,用Kaplan-Meier法计算和绘制生存曲线,并用Log rank法进行单因素分析,计算生存曲线之间的差异,通过COX回归模型进行多因素分析。结果1.MYBL2蛋白表达定位于细胞浆和细胞核。MYBL2蛋白在人食管鳞癌组织中的表达率远远高于癌旁正常上皮组织(71.0%vs 31.8%),差异具有统计学意义(χ2=7.171,P=0.007)。2.MYBL2蛋白的表达水平与食管鳞癌TNM分期及淋巴结转移等恶性生物学行为呈正相关(均P<0.05)。3.生存分析结果显示,MYBL2蛋白的表达水平与食管鳞癌患者预后相关,MYBL2蛋白高表达者比低表达者具有更差的总体生存期(P<0.001)。通过对食管鳞癌预后的COX多因素回归分析,MYBL2蛋白(P=0.003)、肿瘤直径(P=0.001)和淋巴结转移(P<0.001)是食管鳞癌的独立预后因子。第三部分MYBL2基因沉默及过表达对食管鳞癌细胞增殖及迁移侵袭的影响目的探讨MYBL2对食管鳞癌细胞增殖、上皮间质转化及侵袭潜能的影响,并探讨其可能的机制。方法1.食管鳞癌细胞株的筛选:运用RT-PCR法及Western blot法检测TE7、KYSE510、EC9706及EC109四种食管鳞癌细胞株中的MYBL2 mRNA和蛋白表达。选择高表达的EC9706食管鳞癌细胞株,用MYBL2 shRNA慢病毒载体干扰MYBL2的表达,构建MYBL2稳定干扰的EC9706细胞株;选择低表达的KYSE510食管鳞癌细胞株,MYBL2过表达慢病毒载体转染KYSE510,构建MYBL2稳定过表达的KYSE510细胞株。2.MYBL2基因沉默及过表达对食管鳞癌细胞增殖的影响:将细胞分为EC9706对照组,EC9706 MYBL2干扰组,KYSE510对照组和KYSE510 MYBL2过表达组四组,用CCK8法、EdU法检测各组细胞的增殖差异,用流式细胞术检测细胞周期的变化,并用Western blot法检测细胞周期相关蛋白CDK1,CyclinB1及P21的表达变化,采用LinkedOmics数据分析软件分析食管鳞癌组织中MYBL2 mRNA与CDK1 mRNA,CyclinB1 mRNA及P21 mRNA的相关性。3.MYBL2基因沉默及过表达对食管鳞癌细胞上皮间质转化的影响:用细胞划痕实验及Transwell侵袭实验检测各组细胞迁移能力及侵袭能力的改变,用Western blot法及免疫荧光法检测上皮间质转化相关标志物E-cadheri和Vimentin蛋白的表达变化,用Western blot法检测JAK2-STAT3通路关键蛋白STAT3、p-STAT3的表达变化,采用LinkedOmics数据分析软件分析食管鳞癌组织中MYBL2 mRNA与E-cadherin mRNA及Vimentin mRNA的相关性。4.AG490(JAK2-STAT3通路抑制剂)处理对MYBL2介导的食管鳞癌细胞EMT过程的影响:实验分成以下三组:KYSE510对照组,KYSE510 MYBL2稳定过表达组,KYSE510 MYBL2稳定过表达组+AG490处理组,采用Western blot法检测三组细胞MYBL2、E-cadherin、Vimentin以及STAT3、p-STAT3蛋白的表达变化。结果1.食管鳞癌细胞株的筛选:在MYBL2 mRNA水平,四种鳞癌细胞的表达水平为EC9706>Eca109>TE-7>KYSE510;在MYBL2蛋白水平,四种鳞癌细胞的表达水平为EC9706>Eca109>TE-7>KYSE510;根据各细胞株中MYBL2的表达水平,选择EC9706为MYBL2高表达细胞株,选择KYSE510为MYBL2低表达细胞株。2.MYBL2基因沉默及过表达对食管鳞癌细胞增殖的影响:MYBL2 shRNA稳定转染EC9706细胞株后,细胞增殖能力明显下降(P<0.05),可使细胞停滞在G2/M期(P<0.05),阻止细胞周期进程,并且可抑制细胞周期相关蛋白CDK1,CyclinB1的表达(均P<0.05)以及促进细胞周期抑制蛋白P21的表达(P<0.05);MYBL2过表达载体稳定转染KYSE510细胞株后,细胞增殖能力明显增强(P<0.05),可使细胞周期S期细胞大量增加(P<0.05),加快细胞周期进展,并且可促进细胞周期相关蛋白CDK1,CyclinB1的表达(均P<0.05)以及抑制细胞周期抑制蛋白P21的表达(P<0.05);LinkedOmics数据分析软件分析MYBL2 mRNA与CDK1 mRNA,CyclinB1 mRNA及P21 mRNA的相关性。结果显示MYBL2mRNA表达水平与CDK1 mRNA,CyclinB1 mRNA表达水平呈明显正相关(均P<0.001),与P21 mRNA表达水平呈显著负相关(P<0.001)。以上结果提示MYBL2可能通过调控细胞周期进展来促进食管鳞癌细胞增殖。3.MYBL2基因沉默及过表达对食管鳞癌细胞迁移侵袭的影响:MYBL2 shRNA稳定转染EC9706细胞株后,细胞迁移能力及侵袭能力明显下降(均P<0.05),并且E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05),Vimentin蛋白表达降低(P<0.05)STAT3、p-STAT3蛋白表达降低(P<0.05);MYBL2过表达载体稳定转染KYSE510细胞株后,细胞迁移能力及侵袭能力增强(P<0.05),并且E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05),Vimentin蛋白表达增强(P<0.05),STAT3、p-STAT3蛋白表达明显增强(P<0.05)。免疫荧光结果证实,在食管鳞癌细胞株中干扰或过表达MYBL2之后对E-cadherin、Vimentin蛋白的表达影响与Western blot结果一致。LinkedOmics数据分析软件分析结果显示食管鳞癌组织中MYBL2 mRNA与EMT关键标志分子E-cadherin mRNA呈明显负相关。以上结果提示MYBL2可能通过促进食管鳞癌的上皮间质转化过程来促进食管鳞癌细胞迁移侵袭,且MYBL2可以影响JAK2-STAT3信号通路关键蛋白STAT3和p-STAT3的表达。4.AG490处理对MYBL2介导的食管鳞癌细胞EMT过程的影响:MYBL2过表达载体稳定转染KYSE510细胞株之后,再采用JAK2-STAT3抑制剂AG490阻断STAT3的活化;实验分成以下三组:KYSE510对照组,KYSE510 MYBL2稳定过表达组,KYSE510 MYBL2稳定过表达组+AG490处理组;结果显示,与KYSE510 MYBL2稳定过表达组相比,KYSE510 MYBL2稳定过表达+AG490处理组中,E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05),Vimentin蛋白的表达水平下降(P<0.05),上述结果表明JAK2-STAT3信号通路可能部分参与MYBL2介导的食管鳞癌细胞的EMT的发生。第四部分MYBL2阻断对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长及增殖的影响目的研究MYBL2 shRNA在体内对食管鳞癌细胞生长及增殖的影响。方法1.建立EC9706食管鳞癌裸鼠移植瘤模型:将EC9706 MYBL2 shRNA稳转株、EC9706阴性对照组细胞分别注入裸鼠腋背部皮下,并绘制生长曲线。2.实验结束后,取瘤称重,测量体积并拍照。HE染色观察食管鳞癌移植瘤组织学形态;免疫组织化学方法检测移植瘤中MYBL2、Ki67、CDK1,CyclinB1、E-cadherin、Vimentin蛋白的表达。结果1.实验结束时,与阴性对照组相比,MYBL2 shRNA组中移植瘤体积(mm3)(826.63±266.22 vs1626.99±651.11)和重量(g)(0.92±0.16 vs 1.79±0.56)明显减少(均P<0.05)。2.MYBL2 shRNA组中MYBL2蛋白表达量显著低于阴性对照组(P<0.01),提示MYBL2 shRNA在食管鳞癌移植瘤中对MYBL2的抑制效率较高;MYBL2 shRNA组中Ki67蛋白表达量显著低于阴性对照组(P<0.01)。提示MYBL2 shRNA在食管鳞癌移植瘤中明显抑制细胞增殖;MYBL2 shRNA组中CDK1和CyclinB1蛋白表达量显著低于阴性对照组(均P<0.01),提示MYBL2 shRNA在食管鳞癌移植瘤中明显抑制细胞周期相关蛋白的表达;与阴性对照组相比,MYBL2 shRNA组中E-cadherin蛋白表达量增加(P<0.01),Vimentin蛋白的表达量明显减少(P<0.01),提示MYBL2 shRNA在食管鳞癌移植瘤中发挥抑制EMT过程的作用。第五部分 miR-29c-3p靶向MYBL2基因调控食管鳞癌增殖及迁移侵袭的机制研究目的探讨miR-29c-3p对MYBL2基因的调控作用,并探讨miR-29c-3p对食管鳞癌增殖及迁移侵袭的调控作用。方法1.预测筛选调控MYBL2的靶miRNAs:采用生物信息学软件Targetscan预测调控MYBL2表达的miRNAs;进一步采用基因表达数据库GEO数据库中食管鳞癌病例癌组织及癌旁组织miRNAs表达谱数据集GSE43 732和GSE114110,分析靶miRNAs在食管鳞癌组织中的表达水平;并采用LinkedOmics数据分析平台分析靶miRNAs的表达对食管癌患者预后的影响,以及分析其与MYBL2 mRNA的相关性。2.miR-29c-3p表达变化对MYBL2mRNA和蛋白表达的影响:采用miR-29c-3p模拟物(Mimics)和miR-29c-3p抑制物(Inhibitor)分别活化及抑制miR-29c-3p的表达,将实验分成以下四组:Mimics-control组,miR-29c-3p Mimics组,Inhibitor-control组,miR-29c-3p Inhibitor组,采用RT-PCR技术检测各组miR-29c-3p的表达变化,验证miR-29c-3p的活化及抑制效果;采用RT-PCR和Western blot法检测各组MYBL2的表达变化,验证miR-29c-3p活化及抑制对MYBL2表达的影响。3.双荧光素酶表达实验验证miR-29c-3p对MYBL2的靶向调控:将Mimics-control组和miR-29c-3p Mimics 组细胞分别转染MYBL2野生型(MYBL23’UTR-WT)质粒和MYBL突变型(MYBL2 3’UTR-MUT)质粒,采用双荧光素酶报告系统验证miR-29c-3p与MYBL2的靶向关系。4.miR-29c-3p表达变化对食管鳞癌细胞株的增殖,迁移及侵袭的影响:采用miR-29c-3p模拟物和miR-29c-3p抑制物分别活化及抑制miR-29c-3p的表达,将实验分成以下四组:Mimics-control组,miR-29c-3p Mimics 组,Inhibitor-control组,miR-29c-3p Inhibitor组,采用CCK8法、EdU法检测各组细胞的增殖差异,采用Transwell迁移和侵袭实验检测各组细胞的迁移能力和侵袭能力的变化。5.miR-29c-3p通过调控MYBL2的表达介导食管鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭的过程:将MYBL2过表达慢病毒质粒和miR-29c-3p Mimics共转染,实验分为以下三组:Mimics-control+NC 质粒组,miR-29c-3p Mimics+NC 质粒组和miR-29c-3p Mimics+MYBL2质粒三组。首先采用Western blot技术检测各组细胞MYBL2的表达,再采用CCK8法、EdU法检测各组细胞的增殖差异,采用Transwell迁移和侵袭实验检测各组细胞的迁移能力和侵袭能力的变化。结果1.预测筛选调控MYBL2的靶miRNAs:生物信息学软件Targetscan预测结果提示miR-29家族存在与MYBL2 3’UTR端结合的调控位点;采用基因表达数据库GEO数据库中食管鳞癌病例癌组织及癌旁组织miRNAs表达谱数据集GSE43732和GSE114110分析miR-29家族成员的表达情况,结果发现miR-29c-3p在食管鳞癌癌组织较癌旁组织中表达明显降低(P<0.001),且表达差异倍数最为显著;LinkedOmics数据平台分析结果发现,食管癌病例中miR-29c-3p 与MYBL2的表达呈负相关(P<0.001)。综上所述,最终选择miR-29c-3p进行下一步实验。2.miR-29c-3p表达变化对MYBL2mRNA和蛋白表达的影响:RT-PCR结果证实miR-29c-3p Mimics组与对照组相比,miR-29c-3p表达明显上调(P<0.001);miR-29c-3p Inhibitor 与对照组相比,miR-29c-3p 表达下调(P<0.05);miR-29c-3p活化后,MYBL2的mRNA 水平及蛋白水平明显下调(均P<0.01);抑制miR-29c-3p的表达后,MYBL2的mRNA 水平及蛋白水平表达上调(均P<0.05)。3.双荧光素酶表达实验验证结果:与Mimics-control+MYBL2 WT组相比,miR-29c-3p Mimics+MYBL2 WT组细胞中荧光素酶活性明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与Mimics-control+MYBL2 MUT 组相比,miR-29c-3p Mimics-control+MYBL2 MUT组细胞中荧光素酶活性无明显变化。4.miR-29c-3p表达变化对食管鳞癌细胞株的增殖,迁移及侵袭的影响:miR-29c-3p活化,可明显抑制食管鳞癌细胞株的增殖,迁移及侵袭(均P<0.05);抑制miR-29c-3p的表达可以促进食管鳞癌细胞株的增殖,迁移及侵袭(均P<0.05)。5.miR-29c-3p通过调控MYBL2的表达介导食管鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭的过程:上述实验证实miR-29c-3p Mimics可明显抑制MYBL2的表达,现采用MYBL2过表达慢病毒质粒和miR-29c-3p Mimics共转染的方法恢复MYBL2的表达,将细胞分为Mimics-control+NC质粒组,miR-29c-3p Mimics+NC质粒组和miR-29c-3p Mimics+MYBL2质粒三组。结果证实,与miR-29c-3p Mimics+NC质粒组相比,miR-29c-3p Mimics+MYBL2质粒组中MYBL2的表达恢复(P<0.05),且细胞增殖活力及细胞迁移侵袭能力增强(均P<0.05)。结果提示,miR-29c-3p可能通过调控MYBL2的表达介导食管鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭的过程。结论1.MYBL2蛋白在人食管鳞状细胞癌组织中呈高表达,并影响食管鳞癌患者预后。2.MYBL2可能通过调控细胞周期进展促进食管鳞癌细胞增殖。3.MYBL2参与食管鳞癌的EMT,进而增强食管鳞癌的侵袭力。4.miR-29c-3p对MYBL2基因具有靶向负调控作用。