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以肺部纤维化和出血性坏死为主要特征的猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是一种对养猪业影响巨大的呼吸道疾病,由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)感染引起探究其感染肺部致病的分子细胞机制,发现目前市场上的疫苗保护效果不佳,因此寻找新的疫苗候选分子具有重要意义。宿主在细菌感染后,会引起体内细胞因子等产生重要变化,从而调节机体的获得性免疫,该研究结果对于疫苗的。为了了解小鼠在APP感染后,细胞因子等的变化,进行了本研究。APP滴鼻感染小鼠,48h后尸检或宰杀动物,取肺部组织,一部分利用HE染色法观察肺组织病变,一部分用于Q-PCR方法检测干扰素调节因子家族(Interferon regulatory factor,IRF)、白介素(Interleukin,IL)因子、toll样受体(Toll-like receptor,TLR)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)等相关因子的表达量变化情况。结果显示,感染APP后小鼠表现出呼吸困难和厌食。在尸体解剖中,发现肺部组织急性出血性肺。组织病理学结果显示嗜酸性粒细胞和淋巴细胞明显增多。Q-PCR检测结果表明与对照组相比IL-8、IL-10、NLRP-3的mRNA表达显著增加。TLR家族中TLR-2、TLR-4与对照组相比mRNA表达量显著增加,IRF家族中IRF-1、IRF-5、IRF-7 mRNA与对照组相比呈显著性增加。IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α表达升高,可能参与APP感染的发病过程。TLR-2、4可能调节小鼠炎症反应过程中IRF-7和IRF-5的表达。NLRP-3炎症小体在APP感染期间参与小鼠炎症反应。细菌的细胞膜表面蛋白免疫动物可能有效的免疫保护作用。为了验证我们前期工作发现APP可能表达的膜蛋白NLPI(New lipoprotein I)的免疫保护效果。根据GenBank中已发表的APP nlpi基因序列设计引物对,然后以APP的基因组为模板PCR扩增nlpi基因,测序后进行生物信息学分析,发现该基因由900 bp组成,编码一个含299个氨基酸的蛋白质,为一外膜脂蛋白,与该编码蛋白在APP不同的血清型之间具有很高同源性。与细菌细胞外膜表面蛋白具有相互作用,分析表明NLPI参与细胞分裂过程。在细胞分裂过程中具有将nlpi亚克隆至pET32a(+)载体,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达APP rNLPI蛋白,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和West-blot检测。结果表明,在34 kD处有特异性条带,可被相应的阳性血清识别。动物保护实验采用BALB/c小鼠(Mus musculus)进行,免疫球蛋G(Immunoglobulin G,IgG)抗体滴度采用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测。结果表明弗氏不完全佐剂+50μg rNLPI、弗氏不完全佐剂+30μg rNLPI、弗氏不完全佐剂+10μg rNLPI、30μg rNLPI免疫后,可诱导小鼠分别产生40%、20%、10%和20%存活率。佐剂组和生理盐水对照组全部死亡。存活小鼠精神状况慢慢恢复正常,并采食。可见,rNLPI皮下免疫可诱导小鼠产生免疫应答和较高的抗攻击感染的免疫保护力。弗氏不完全佐剂具有类似的调节机体细胞因子表达,从而影响IgG表达的作用,本实验可见弗氏不完全佐剂对该分子无显著的免疫增强作用。该结果为进一步筛选猪传染性胸膜肺炎分子疫苗积累了基础资料。