研究背景:严重创烧伤后组织修复障碍,导致创面封闭延迟甚至难愈,是影响烧伤患者整体救治,造成伤亡、伤残的重要原因。迅速再上皮化形成新生表皮组织在严重创烧伤创面封闭中起关键作用。新生表皮组织维持旺盛的增殖潜能和较高的抗凋亡能力是其不断扩增完成再上皮化的必要条件,而表皮干细胞及前体祖细胞数量是决定新生表皮组织增殖潜能和抗凋亡能力的关键因素。表皮干细胞及前体祖细胞数量进一步取决于表皮干细胞向前体祖细胞分化增殖和向终末分化细胞过度分化之间的平衡关系。根据文献报道,表皮干细胞的增殖分化过程可大致分为4个阶段:表皮干细胞的自我更新、表皮干细胞分化为前体祖细胞、前体祖细胞的增殖扩增、前体祖细胞分化为终末期细胞。其中表皮干细胞自我更新及表皮干细胞分化为前体祖细胞的过程相对较为缓慢,但是这两个阶段的细胞增殖潜能和抗凋亡能力较强;相反,前体祖细胞分化为终末期表皮细胞的过程较为迅速,但该阶段的细胞增殖潜能和抗凋亡能力较弱。因此,表皮干细胞增殖分化过程是创面再上皮化的细胞学基础。既往研究表明,作为皮肤组织免疫系统中重要组成成分,DETCs具有强烈的促再上皮化能力并在创面组织修复中发挥重要作用。皮肤损伤后,周围DETCs迅速活化迁移到创缘表皮组织中,并功能性高表达IGF-1等生长因子促进再上皮化过程,改善创面愈合。但DETCs是否通过调控表皮干细胞增殖分化促进创面愈合这一核心问题,至今尚未见任何相关研究报道。本研究拟从DETCs通过分泌IGF-1促进创面愈合、DETCs与IGF-1调节创面新生表皮组织中表皮干细胞和表皮终末分化细胞数量、DETCs和IGF-1直接调控表皮干细胞增殖分化三个方面阐明DETCs是否通过分泌IGF-1直接调控表皮干细胞增殖分化来促进皮肤创面愈合。研究目的:阐明DTECs通过促进表皮干细胞增殖分化来加速创面再上皮化过程,改善创面愈合。研究方法:一、DETCs分泌IGF-1促进创面愈合。取野生型小鼠和TCRδ^-/-小鼠,构建创面愈合模型,观察两组小鼠各时间点剩余创面面积百分比,比较创面愈合情况。随后于TCRδ^-/-小鼠创面皮下注射体外分离培养的小鼠DETCs,构建TCRδ^-/-+DETCs模型,观察创面愈合情况,明确DETCs在创面愈合过程中的作用。分别提取野生型小鼠、TCRδ^-/-小鼠和TCRδ^-/-+DETCs小鼠创缘表皮组织,用流式细胞技术和WB技术检测表皮组织IGF-1表达情况,明确DETCs通过分泌IGF-1参与创面愈合。最后于TCRδ^-/-小鼠创面皮下注射重组小鼠IGF-1,构建TCRδ^-/-+IGF-1模型,观察创面愈合情况,明确IGF-1在创面愈合过程中的作用。二、DETCs和IGF-1显著增加创面新生上皮组织中表皮干细胞的数量,并显著减少创面新生表皮组织中表皮终末分化细胞的数量。取野生型小鼠构建BrdU动物模型,通过BrdU标记小鼠表皮干细胞。模型构建成功后,提取野生型小鼠、TCRδ^-/-小鼠、TCRδ^-/-+IGF-1小鼠和TCRδ^-/-+DETCs鼠的新生表皮组织,用免疫组织化学技术检测BrdU标记的表皮干细胞,明确DETCs和IGF-1对于新生上皮组织中表皮干细胞数量的影响。另提取上述四组小鼠新生表皮组织,用免疫荧光技术检测K15阳性表皮干细胞,进一步证实DETCs和IGF-1对于新生上皮组织中表皮干细胞数量的影响。另提取上述四组小鼠新生表皮组织,用免疫荧光技术检测K10阳性表皮终末分化细胞,明确DETCs和IGF-1对于新生上皮组织中表皮终末分化细胞数量的影响。三、DETCs和IGF-1可直接调控体外培养表皮干细胞的增殖分化。体外分离培养小鼠表皮干细胞和小鼠DETCs,将二者共培养,构建表皮干细胞-DETCs共培养模型。体外分离培养小鼠表皮干细胞,并施以重组小鼠IGF-1刺激,构建表皮干细胞-IGF-1刺激模型。通过流式细胞技术,对表皮干细胞-DETCs共培养模型和表皮干细胞-IGF-1刺激模型中的表皮干细胞行EdU和CD49f-CD71染色,明确DETCs和IGF-1对于表皮干细胞增殖和干性维持的影响。通过流式细胞技术,检测表皮干细胞-DETCs共培养模型和表皮干细胞-IGF-1刺激模型中的K14阳性细胞和K10阳性表皮终末分化细胞比例,明确DETCs和IGF-1对于表皮干细胞向表皮终末期细胞分化的影响。研究结果:一、DETCs分泌IGF-1促进创面愈合1.缺乏DETCs导致小鼠创面愈合延迟。构建皮肤创面模型。造创后第4、6、8日野生型小鼠和TCRδ^-/-小鼠剩余创面百分比存在显著差异,TCRδ^-/-小鼠创面愈合速度较野生型小鼠显著延迟。2.创面过继输入DETCs显著促进小鼠创面愈合。构建皮肤创面模型。造创后第4、6、8日TCRδ^-/-小鼠和TCRδ^-/-+DETCs小鼠剩余创面百分比存在显著差异,TCRδ^-/-小鼠创面过继输入DETCs显著促进创面愈合速度。3.IGF-1是DETCs促进创面愈合的关键效应分子。（1）TCRδ^-/-小鼠创缘表皮组织中IGF-1蛋白表达较野生型小鼠显著降低,而TCRδ^-/-小鼠创面过继输入DETCs显著提高了创缘表皮组织中IGF-1蛋白表达。（2）TCRδ^-/-小鼠创缘表皮组织中DETCs表达IGF-1的比例较野生型小鼠显著降低,而TCRδ^-/-小鼠创面过继输入DETCs显著提高了创缘表皮组织中DETCs表达IGF-1的比例,表明DETCs是小鼠创缘表皮组织中分泌IGF-1的最主要细胞。（3）构建皮肤创面模型。造创后第4、6、8日TCRδ^-/-小鼠和TCRδ^-/-+IGF-1小鼠剩余创面百分比存在显著差异,TCRδ^-/-小鼠创面过继输入IGF-1显著促进创面愈合速度。二、DETCs和IGF-1显著增加创面新生上皮组织中表皮干细胞的数量1.创面新生上皮组织BrdU标记表皮干细胞检测。构建BrdU标记表皮干细胞动物模型,提取新生表皮组织,通过免疫组织化学技术,显示TCRδ^-/-组小鼠新生表皮组织中BrdU标记表皮干细胞数量为5.00±3.00/视野,明显少于野生型组48.67±3.06/视野（P<0.0001）;TCRδ^-/-+DETCs组小鼠新生表皮组织中BrdU标记表皮干细胞数量为31.00±3.61/视野,TCRδ^-/-+IGF-1组小鼠新生表皮组织中BrdU标记表皮干细胞数量为24.67±2.08/视野,均明显多于TCRδ^-/-组5.00±3.00/视野（P<0.0001,P<0.001）。2.创面新生上皮组织K15阳性表皮干细胞检测。构建创面模型,提取新生表皮组织,通过免疫荧光技术,显示TCRδ^-/-组小鼠新生表皮组织中K15阳性表皮干细胞数量为11.67±4.04/视野,明显少于野生型组163.30±14.05/视野（P<0.0001）;TCRδ^-/-+DETCs组小鼠新生表皮组织中K15阳性表皮干细胞数量为103.30±12.66/视野,TCRδ^-/-+IGF-1组小鼠新生表皮组织中K15阳性表皮干细胞数量为41.00±5.29/视野,均明显多于TCRδ^-/-组11.67±4.04/视野（P<0.0001,P<0.05）。三、DETCs和IGF-1显著减少创面新生表皮组织中表皮终末分化细胞的数量创面新生上皮组织K10阳性表皮终末分化细胞检测。构建创面模型,提取新生表皮组织,通过免疫荧光技术,显示TCRδ^-/-组小鼠新生表皮组织中K10阳性表皮终末分化细胞数量为69.00±9.54/视野,明显多于野生型组4.33±1.53/视野（P<0.0001）;TCRδ^-/-+DETCs组小鼠新生表皮组织中K10阳性表皮终末分化细胞数量为12.67±3.79/视野,TCRδ^-/-+IGF-1组小鼠新生表皮组织中K10阳性表皮终末分化细胞数量为43.33±8.51/视野,均明显少于TCRδ^-/-组69.00±9.54/视野（P<0.0001,P<0.01）。四、DETCs和IGF-1在体外增强表皮干细胞增殖和干性维持能力1.EdU阳性增殖细胞检测。体外培养表皮干细胞,构建表皮干细胞-DETCs共培养模型和表皮干细胞-IGF-1刺激模型。通过流式细胞技术,显示对照组EdU阳性增殖细胞比例为32.30±1.27（%）,明显低于DETCs共培养组的43.53±0.62（%）（P<0.01）;对照组EdU阳性增殖细胞比例为32.43±0.69（%）,明显低于IGF-1刺激组的42.13±0.92（%）（P<0.01）。表明DETCs和IGF-1促进表皮干细胞增殖。2.CD49f⁺-CD71^-细胞检测。体外培养表皮干细胞,构建表皮干细胞-DETCs共培养模型和表皮干细胞-IGF-1刺激模型。通过流式细胞技术,显示对照组CD49f⁺-CD71^-细胞比例56.40±0.32（%）,明显低于DETCs共培养组的66.53±0.50（%）（P<0.0001）;对照组CD49f⁺-CD71^-细胞比例为74.90±0.73（%）,明显低于IGF-1刺激组的81.13±1.27（%）（P<0.05）。表明DETCs和IGF-1促进表皮干细胞增殖的同时提高干细胞的比例。五、DETCs和IGF-1在体外抑制表皮干细胞向终末期细胞分化1.K14阳性细胞检测。体外培养表皮干细胞,构建表皮干细胞-DETCs共培养模型和表皮干细胞-IGF-1刺激模型。通过流式细胞技术,显示对照组K14阳性细胞比例为54.90±1.32（%）,明显低于DETCs共培养组的69.27±1.70（%）（P<0.001）;对照组K14阳性细胞比例为52.00±1.80（%）,明显低于IGF-1刺激组的66.83±0.97（%）（P<0.01）。表明DETCs和IGF-1抑制表皮干细胞分化。2.K10阳性表皮终末分化细胞检测。构建表皮干细胞-DETCs共培养模型和表皮干细胞-IGF-1刺激模型。通过流式细胞技术,显示对照组K10阳性表皮终末分化细胞比例为67.13±1.19（%）,明显高于DETCs共培养组的55.67±0.70（%）（P<0.01）;对照组K10阳性表皮终末分化细胞的比例为58.17±0.30（%）,明显高于IGF-1刺激组的53.53±1.12（%）（P<0.05）。进一步表明DETCs和IGF-1抑制表皮干细胞向表皮终末期细胞分化。研究结论:DETCs可通过分泌IGF-1促进表皮干细胞的增殖并抑制其向终末分化细胞分化,从而增加创面新生表皮组织中表皮干细胞的数量比例并减少表皮终末分化细胞的数量比例,提高新生表皮组织的增殖和抗凋亡潜能,促进创面再上皮化进程,改善创面愈合。