由于全球工业化进程和人类生产活动的加剧，土壤重金属污染已成为全球面临的一个急待解决的环境问题。重金属胁迫条件下，植物最明显的表现是叶、根部的生长受到抑制，重金属对植物生长发育及形态的影响可称作胁迫诱导的形态响应。胁迫诱导的形态响应被认为是植物的一种驯化适应策略，并借此调整生长以减缓胁迫造成的伤害，而且这种响应与植物体内激素的代谢尤其是生长素的动态平衡以及ROS的水平密切相关。植物可利用GH3蛋白控制体内生长素的动态平衡，生长素水平的变化可直接影响扩展蛋白的表达和功能。一些报道己指出GH3基因和扩展蛋白基因参与了植物对渗透、干旱以及盐胁迫的响应过程，但很少见到这两类基因参与植物重金属胁迫响应的报道。本文从重金属富集植物印度芥菜(Brassica Juncea L.)叶片材料中分别克隆了一个GH3基因BjGH3.1和一个扩展蛋白基因BjEXPA1，并克隆了这两个基因的启动子序列。对这两个基因的表达模式和功能进行研究分析，试图揭示这两个基因在植物响应重金属胁迫过程中的功能和作用。　　 ⑴印度芥菜BjGH3.1基因的克隆及其功能分析。在先前的工作中，我们从镉处理的印度芥菜(Brassica juncea L.)材料中利用DDRT技术分离得到一条类GH3基因片段(GH3-like)，通过RACE-PCR技术得到该基因全长序列并命名为BjGH3.1基因。分析表明，BjGH3.1基因ORF全长1779bp编码592个氨基酸，氨基酸序列与拟南芥AtGH3.12蛋白一致性达60％。系统进化树分析表明，BjGH3.1属于拟南芥GH3基因家族第三组。RT-PCR结果显示，在正常生长条件下，BjGH3.1在根、茎和叶中均有表达，茎中表达量最低。干旱、高盐和重金属胁迫及IAA、SA外源激素处理均可诱导BjGH3.1的表达。BjGH3.1启动子序列含有多种胁迫、激素响应的顺式元件以及组织特异性表达顺式元件。尽管BjGH3.1可以响应IAA处理而上调表达，但其启动子序列内并没有生长素响应元件TGTCTC，取而代之的是TGTCAC，这与在辣椒CcGH3基因启动子序列中的发现一致。启动子序列不含有生长素响应元件的拟南芥GH3基因也可响应IAA处理而上调表达，这些结果说明启动子序列内可能还存在其他生长素响应元件。过量表达BjGH3.1可以显著提高转基因烟草的Cd抗性，减轻Cd胁迫对植物根生长的抑制。实时荧光定量PCR结果显示，过量表达BjGH3.1基因可上调ERF转录因子家族基因ERF5和EREBP-1的表达。尽管转基因烟草中PR-1α基因的表达没有显著的增强，但Cd胁迫下，该基因在转基因烟草中的表达是野生型烟草的18倍，ERF与PR-1a基因都与植物体内的SA信号途径相关，说明BjGH3.1蛋白可能通过SA信号途径调控下游胁迫响应基因的表达参与植物对重金属胁迫的适应过程，结果也显示重金属胁迫信号途径与SA信号途径存在交叉对话。　　 ⑵印度芥菜BjEXPA1基因及其上游启动子序列的克隆及其功能分析。利用同源克隆技术从印度芥菜的叶片中分离得到一条扩展蛋白基因BjEXPA1，序列分析显示BjEKPA1基因ORF全长750bp共编码249个氨基酸，BjEXPA1与拟南芥扩展蛋白AtEXPA1氨基酸序列具有92%的一致性。BjEXPA1蛋白属于α家族扩展蛋白，成熟蛋白具有该家族蛋白的典型特征。RT-PCR分析表明，BjEXPA1在印度芥菜根茎叶中均有表达，在叶部的表达量显著高于根部和茎部。叶片中BjEKPA1基因的表达受ABA、重金属、盐胁迫的抑制，但GA3可提高其mRNA的水平。BjEXPA1基因上游启动子区域含有大量激素和胁迫响应元件以及控制基因组织特异性表达的顺式元件，GUS染色结果显示BjEXPA1启动子驱动的GUS基因的表达具有时空特异性，在植物气孔、维管束以及离层组织内均有GUS活性，荧光GUS酶活性分析结果显示GA3、IAA处理可上调启动子活性，而ABA、重金属、干旱以及盐胁迫处理可抑制其活性。过量表达BjEAPA1基因改变了烟草的叶片的形状以及根部的正常生长发育，导致植物体内H2O2含量和POD酶活性的上升。与野生型烟草相比，持续表达BjEXPA1降低了植物对重金属Cd的耐性，加剧了转基因烟草中膜脂过氧化伤害程度以及根生长的抑制。转基因植物对Cd敏感性的增加可能是由于BjEXPA1的过量表达导致了植物生长发育发生紊乱，从而对植物造成伤害；也可能足由于扩展蛋白的持续表达导致了植物细胞壁的崩溃，从而使累积在细胞壁内的Cd离子更易对植物造成伤害。