目的:癌症是威胁人类生命的头等杀手。目前恶性肿瘤的药物治疗中是以化学药品为主,但化学药品的开发费用昂贵,毒副作用大,多有不同程度的致突变毒性。因此,人们把目光转向中药,试图从天然成分中寻找毒副作用小,作用独特的抗肿瘤药物。中药抗肿瘤作用具有多靶点、多环节、多效应的特点,可作用于肿瘤发生、发展的多个环节,同时其毒副作用低,能提高机体免疫力,不易产生耐药性,为近年来研究的热点。我国是世界上肝癌的高发区,而且高发的趋势十分严峻,近20年来我国肝癌的死亡率增加了41.7%。我国肝癌主要集中在东南沿海一带,如江苏、福建、广东、广西等省份。全世界每年大约有125万人死于肝癌,其中有近一半发生在我国。据20世纪90年代的统计,中国肝癌的世界人口调查死亡率在男性为33.7/万,分别是日本的2.2倍,意大利的4.6倍;在女性为12.3/万,分别为日本的3.1倍,意大利的5.1倍[1]。我国白血病发病率为2.76/10万,且白血病是儿童期最常见的恶性肿瘤,可发生于儿童的各年龄段,严重威胁着患儿生命[2]。目前对白血病的治疗仍以化疗为主,但仍有部分患者诱导治疗未获完全缓解率(CR)或缓解后复发,大多数患者很难达到长期无病生存,导致临床治疗的最终失败[3]。因而如何进一步提高诱导缓解率和持续完全缓解率(CCR),是目前急性白血病研究领域中的难点和热点。HepG2是来源于人肝癌的细胞株,形态类似于正常肝实质细胞,所含有的生物转化酶系与人正常肝实质细胞的生物转化酶系具有同源性。但生物学特性比正常肝实质细胞活跃,可以大量分泌肝胚胎期的蛋白,如甲胎蛋白(AFP),也可少量分泌正常肝实质细胞的蛋白,比用来源于啮齿类动物的活化系统具有更高的可靠性。HL-60细胞是人早幼粒白血病细胞株,是诱导细胞分化比较理想的实验模型,在诱导分化过程中除了有明确的形态改变外,也有可靠的反映细胞功能的细胞化学指标,特别是反映细胞吞噬功能的NBT(硝基四氮唑蓝)还原能力的增强是公认的粒系细胞分化的标志。实验通过对复方木鸡冲剂作用于人肝癌细胞HepG2、人白血病细胞HL-60等细胞后,观察肿瘤细胞在生长、凋亡和分化方面的变化,旨在分析复方木鸡冲剂对肿瘤细胞的杀伤作用及其机制,为中药在临床上的广泛应用提供有关的实验和理论依据。方法:1.对肿瘤细胞的生长抑制作用:1.1细胞培养:HepG2、Hela和A549为贴壁生长的细胞,HL-60、K562和Raji为悬浮细胞,HepG2细胞接种在DMEM全培养基中,2~3天换液一次;其余细胞接种在RPMI-1640全培养基中,37℃,5%CO2,饱和湿度孵箱中孵育,每2天换液一次,取对数生长期细胞进行实验。1.2 MTT比色法检测细胞增殖活性:取对数生长期细胞进行实验,实验设空白对照组,阳性药物对照组(β-榄香烯)及木鸡冲剂组,每组设4个平行孔。各种细胞分别培养24h,48h,72h后进行检测,在自动酶标仪上以570nm波长测定各孔OD值,计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率:抑制率(fa)=(1-实验组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100% 2.诱导凋亡的检测: 2.1细胞形态学观察:取对数生长期的细胞,木鸡冲剂作用后,光镜下观察用药前后细胞形态的变化。2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳:取对数生长期HL-60细胞进行实验,实验设空白对照组,阳性药物对照组及木鸡冲剂组,分别在培养24h和48h后,收集细胞,提取基因组DNA,在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳,紫外灯下观察结果。2.3流式细胞仪(Annexin V/PI双染法)检测细胞凋亡:收集药物作用后的细胞,PBS冲洗两次,然后用1×Binding Buffer悬浮细胞,加入Annexin V-EGFP和PI,在室温下避光反应15min后上机检测凋亡发生情况。2.4流式细胞仪分析细胞周期:收集药物作用后的细胞,PBS冲洗两次,用70%乙醇4℃固定过夜,与含RNase的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)孵育30min,PI染色30min,流式细胞仪分析DNA含量及细胞周期。2.5应用免疫细胞化学的方法检测Bcl-2和Caspase-3表达情况:收集药物作用24h、48h和96h后的HL-60细胞,按照免疫细胞化学试剂盒说明书进行操作,显微镜下观察药物作用后蛋白的表达情况。3.诱导HL-60细胞分化的检测:3.1形态学观察:收集药物作用48h后的细胞,涂片,瑞氏-姬姆萨染色,显微镜下观察药物作用后细胞的形态变化,常规培养细胞作为空白对照。3.2硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验:收集药物作用48h后的细胞,加入NBT溶液和佛波酯(TPA)溶液作用后,取细胞悬液涂片,瑞氏-姬姆萨染色,油镜下随机计数200个细胞,其中含有蓝紫色斑的为阳性细胞,计算阳性细胞所占百分比,实验重复三次,计算平均值。3.3过氧化物酶(POX)染色:收集药物作用后48h后的细胞,做过氧化物酶染色,观察胞浆中过氧化物酶的变化情况,常规培养细胞作为空白对照。3.4流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD11b、CD14:收集药物作用后的HL-60细胞,离心弃上清,加人荧光标记的CD14、CD11b抗体进行标记,用流式细胞仪检测,常规培养细胞作为空白对照。3.5免疫细胞化学方法检测细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子P21WAF1的表达:用免疫细胞化学方法检测经复方木鸡冲剂作用24h、48h和96h后和空白对照组的HL-60细胞P21WAF1的表达情况。4.诱导HepG2细胞分化的检测:4.1形态学观察:收集药物作用48h后的细胞,涂片,瑞氏-姬姆萨染色,显微镜下观察药物作用后细胞的形态变化,常规培养细胞作为空白对照。4.2全自动生化分析仪检测GGT(γ-谷氨酰转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶):收集药物作用48h后的细胞上清液,全自动生化分析仪检测GGT、ALP的变化,实验重复三次,计算平均值。4.3 AFP(甲胎蛋白)分泌量的测定:收集药物作用48h后的细胞上清液,放射免疫测定法检测AFP的含量,实验重复三次,计算平均值。4.4免疫细胞化学方法检测细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子P21WAF1的表达:对数生长期的HepG2细胞经复方木鸡冲剂作用24h、48h和96h后,收集药物作用组和空白对照组的细胞,按照免疫细胞化学试剂盒说明书进行操作,显微镜下观察药物作用后P21WAF1的表达情况。结果:1.复方木鸡冲剂对肿瘤细胞生长抑制的影响:复方木鸡冲剂对K562、Hela和A549细胞的生长抑制有明显的时间依懒性,随药物作用时间的延长抑制率升高,药物作用24h,48h和96h后,对K562细胞的生长抑制率分别为74.3%,85.6%和91.7%, Hela细胞为54.5%,81.8%和87.6%, A549细胞为33.3%,60.6%和74.3%;而对HL-60、HepG2和Raji细胞的影响随时间的变化抑制率变化不明显,对HL-60细胞的抑制率为64.3%,61.2%和68.5% ; HepG2细胞为63.0%,49.6%和46.6%,Raji细胞为80.5%,72.9%和76.9%,这些结果均显示木鸡冲剂组与对照组相比有显著性差异(p<0.01);除HL-60细胞外,木鸡冲剂组对其他三种细胞三个时间点的生长抑制率也明显高于阳性药物对照组(β-榄香稀)(p<0.01)。2.诱导凋亡的检测:2.1细胞形态的变化:复方木鸡冲剂作用于HL-60细胞48h后,倒置显微镜下观察可见空白对照组细胞数量较多,形态规则,近似圆形,透亮;而药物组细胞数量明显减少,细胞体积固缩,边缘不规则,胞膜有小泡形成,胞浆内出现黑色颗粒,胞核固缩,核质比减小。2.2复方木鸡冲剂作用HL-60细胞后的DNA变化:HL-60细胞经复方木鸡冲剂和β-榄香烯作用24h后出现DNA“梯形带”(DNA ladder),空白对照组DNA无“梯形带”出现。2.3细胞凋亡率的检测:流式细胞仪检测显示,复方木鸡冲剂作用HL-60细胞后,细胞发生凋亡,以木鸡冲剂作用24h的凋亡率增加最明显,达到42.31%,且以细胞早期凋亡(Annexin V+/PI-)为主,与空白对照组比较凋亡率增高,有显著性差异(p<0.05)。复方木鸡冲剂作用HepG2细胞24 h和72 h后,细胞都出现了较为明显的凋亡现象,凋亡率分别为47.07%和48.47%,与空白对照组比较凋亡率增高,有显著性差异(p<0.05)。其中,处理24 h后早期凋亡率和晚期凋亡率差别不大,继续作用72 h后以晚期凋亡细胞为主。2.4复方木鸡冲剂处理HL-60细胞后,细胞周期的变化:流式细胞仪检测可见复方木鸡冲剂作用48h后,有特征性的凋亡峰即亚二倍体峰形成,比例为5.4%,空白对照组为2.5%。同时显示G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,呈现明显的G0/G1期阻滞现象。2.5复方木鸡冲剂处理HL-60细胞后,Bcl-2和Caspase-3的表达情况: Bcl-2的表达在空白对照组呈深棕黄色,而在实验组随着时间延长,颜色逐渐变淡,48h呈浅黄色;Caspase-3的表达在空白对照组呈浅黄色,而在实验组随着时间延长,颜色逐渐变深,48h呈棕黄色。3.复方木鸡冲剂诱导HL-60细胞分化的检测:3.1复方木鸡冲剂作用后HL-60细胞形态学的变化:未作处理的HL-60细胞主要是幼稚的未分化的早幼粒细胞,而经复方木鸡冲剂作用后,中幼粒,晚幼粒细胞增多,并出现杆状核、分叶核粒细胞,表明复方木鸡冲剂促进了HL-60细胞向成熟方向分化。3.2复方木鸡冲剂对HL-60细胞NBT还原能力的影响:复方木鸡冲剂作用后,HL-60细胞中,具有NBT还原能力的细胞明显增多。3.3过氧化物酶(POX)染色:未作处理的HL-60细胞胞浆中无蓝黑色颗粒,而经复方木鸡冲剂作用后,细胞中布满蓝黑色颗粒,表明细胞趋向成熟。3.4复方木鸡冲剂对HL-60细胞表面CD分子的影响:HL-60细胞经复方木鸡冲剂作用72h后,CD11b表达明显增加,CD14变化不大,说明复方木鸡冲剂有诱导HL-60向粒细胞系成熟阶段分化功能。3.5复方木鸡冲剂对HL-60细胞P21 WAF1蛋白表达的影响:HL-60细胞经复方木鸡冲剂作用后,P21 WAF1蛋白定位于HL-60细胞胞浆或胞核中,呈粗大的棕黄色颗粒状。空白对照组HL-60细胞P21 WAF1蛋白表达为阴性。4.复方木鸡冲剂诱导HepG2细胞分化的检测:4.1光镜下观察发现经复方木鸡冲剂处理48h的HepG2细胞形态由原来的卵圆形、多边形为主转变为以长梭形或树枝状,有突起伸出为主,细胞核变小,固缩而深染,染色质凝集,核仁数目变少,胞浆浓缩而深染,核质比例降低。4.2复方木鸡冲剂作用HepG2细胞48h后,上清液中GGT浓度降低,但p>0.05,无统计学差异;ALP浓度由作用前的6.34±0.24U/L升高为12.03±0.18U/L,作用后较作用前有明显升高(p<0.05)。4.3复方木鸡冲剂作用HepG2细胞48h后,上清液中AFP含量降低。4.4复方木鸡冲剂对HepG2细胞P21 WAF1蛋白表达的影响:P21 WAF1蛋白定位于HepG2细胞胞浆或胞核中,呈粗大的棕黄色颗粒状。空白对照组P21 WAF1蛋白表达为阴性。结论:1.复方木鸡冲剂对HepG2、K562、A549、HL-60、Raji以及Hela细胞的增殖有明显的抑制作用,且对K562、Hela和A549细胞的生长抑制有明显的时间依赖性。提示复方木鸡冲剂有较广泛的杀瘤活性。2.复方木鸡冲剂对HepG2细胞、HL-60细胞有明显的诱导凋亡作用,诱导凋亡的机制与Bcl-2表达下调和caspase-3表达上调有关。3.复方木鸡冲剂对HepG2细胞、HL-60细胞有诱导分化的作用,诱导分化的机制与p21WAFI表达上调有关。