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目的2003年国外两个独立的研究小组,发现一组新型干扰素即IFN-λ家族,包括IFN-λ1(IL-29),IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。其与相应的受体结合可以激活JAK-STAT信号通路从而发挥抗病毒感染、抗肿瘤及免疫调节的作用。相比IFN-α,IFN-λ作用于肝细胞后,肝细胞内JAK-STAT信号通路中关键分子STAT1/2磷酸化时间明显延长。且其受体在血液系统和神经系统分布明显少于IFN-α,所以有望用于临床上IFN-α治疗副作用大或无应答的患者。本研究拟通过构建小鼠IFN-λ3真核表达质粒,检测m IFN-λ3的表达情况。并将构建好的质粒通过高压尾静脉注射的方法,注入小鼠体内,研究其在小鼠体内是否能发挥抗HBV作用及其相关机制,为IFN-λ用于临床治疗慢性乙肝患者提供理论依据。方法:1、构建小鼠IFN-λ3(m IFN-λ3)的质粒,设计特异性引物,通过PCR扩增小鼠IFN-λ3编码区全长,将其克隆至克隆载体p MD18-T载体进一步扩增。2、将p MD18-T-m IFN-λ3及真核表达载体p IRES2-EGFP分别用限制内切酶salⅠ和Bam HⅠ双酶切后,再用DNA连接酶进行连接,构建双顺反子表达载体p IRES2-EGFP-m IFN-λ3(pm IFN-λ3)。3、使用脂质体Lipofectamine2000将构建好的表达载体p IRES2-EGFP-m IFN-λ3转染BHK细胞及通过高压尾静脉注射至小鼠体内,检测m IFN-λ3的表达。4、收集BHK-IFN-λ3的培养上清中表达的m IFN-λ3,检测其抗肿瘤细胞增殖及抗病毒生物学活性。5、通过高压尾静脉注射p AAV-HBV1.2质粒构建小鼠HBV复制模型,同时分别高压尾静脉注射pm IFN-λ3、pm IFN-α4、pm IFN-λ3联合pm IFN-α4,观察pm IFN-λ3及其联合pm IFN-α4在小鼠HBV复制模型中抗HBV作用。6、使用ELISA方法,检测不同时间点小鼠体内m IFN-λ3、m IFN-α4、HBsAg、HBe Ag表达情况。7、使用HE染色的方法检测各组不同时间点小鼠肝脏炎症变化。8、收集小鼠血清及肝脏总DNA,使用实时定量PCR(RT-qPCR)检测小鼠血清及肝脏中HBVDNA的变化。9、提取小鼠肝脏总RNA,利用特异性引物进行RT-q PCR,检测肝内转录因子IRF3、IRF5、IRF7、ISG15、USP18、MX1及OAS的变化情况。结果:1、成功构建双顺反子表达质粒p IRES2-EGFP-m IFN-λ3,经PCR、双酶切及测序鉴定,与已知的序列完全吻合,并且成功表达m IFN-λ3。2、p IRES2-EGFP-m IFN-λ3瞬时转染能在BHK细胞中高效表达,24h细胞上清中m IFN-λ3浓度高达1750pg/ml,并可以维持表达高峰至72h。3、BHK细胞瞬时转染表达的m IFN-λ3,能有效抑制A549细胞的增殖,并且具有抗EMCV病毒的保护作用。4、m IFN-λ3在小鼠乙肝复制模型中,可以抑制小鼠血清中HBsAg的表达至15dpi(days post injection,注射后天数),抑制血清中HBe Ag的表达至20dpi,抑制血清中HBV DNA的表达至30dpi;而IFN-λ3联合IFN-α4可以抑制小鼠血清中HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA的表达至30dpi,但是不能抑制肝脏中HBV DNA的复制。5、小鼠HBV复制模型各时期各组小鼠肝脏汇管区可见不同程度的炎症表现。其中以HBV1.2组及HBV1.2+m IFN-λ3组较为明显,提示IFN-α4及IFNλ3+IFN-α4具有良好抑制炎症细胞浸润的作用,而单独IFN-λ3则作用不明显。6、m IFN-λ3单独作用时,肝内IRF3、IRF5、IRF7、ISG15、USP18、OAS及MX1较HBV1.2组轻度升高,但均无统计学差异;m IFN-λ3联合m IFN-α4作用时,dpi24h可见肝内IRF7、ISG15、USP18、OAS及MX1较其他各组有均明显升高,且dpi20d、30d及60d均有不同程度的升高,提示m IFN-λ3联合m IFN-α4在HBV小鼠复制模型中可通过激活JAK-STAT信号通路发挥一定的抗HBV效应。结论:1、本实验成功构建小鼠IFN-λ3的表达质粒(p IRES2-EGFP-mIFN-λ3),可以在BHK细胞和小鼠肝脏中高效表达。2、BHK瞬时转染表达的m IFN-λ3具有抑制A549肿瘤细胞增殖及抗EMCV病毒的保护作用。3、在小鼠HBV复制模型中,共注射p AAV-HBV1.2及pm IFN-λ3组与单独注射p AAV HBV1.2组进行比较,m IFN-λ3明显抑制HBV复制的作用维持至15dpi。4、在小鼠HBV复制模型中,m IFN-λ3联合m IFN-α4与单独注射p AAV-HBV1.2组进行比较,血清中HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA的表达明显受到抑制,且肝内的IRF3,IRF5,IRF7,ISG15,USP18,OAS and MX1等干扰素刺激因子及抗病毒蛋白的表达升高,说明两者联合可以通过激活JAK-STAT信号通路发挥抗HBV的作用。创新点及不足:1、构建m IFN-λ3表达质粒,通过慢性小鼠乙肝模型,研究m IFN-λ3及其联合IFN-α4在此模型上抗HBV作用及机制。2、m IFN-λ3高压尾静脉注射体内很快清除,不能维持小鼠体内m IFN-λ3持续表达,从而持续发挥抗病毒作用。3、m IFN-λ3注射至小鼠体内的量,是否还需要加大,有待进一步研究。4、高压尾注射m IFN-λ3及m IFN-α4,dpi 30d-60d小鼠体内的HBs Ag、HBV DNA持续高于对照组。其具体机制不明确,有待深入研究。