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研究背景及目的衰老是心血管疾病的独立危险因素,包括冠心病、高血压、中风。伴随着年龄的增加,机体内会发生很多年龄相关的功能和结构改变,其中内皮功能紊乱是动脉粥样硬化发生发展的起始阶段。但是血管细胞,尤其是内皮细胞,是如何出现衰老表型,衰老是如何影响血管功能并导致衰老相关的血管疾病,这一过程仍需要大量的研究。微小RNA (MicroRNAs, miRNAs)是一类小的非编码RNA,在调节内皮细胞衰老方面发挥重要调控作用。已知的芯片结果发现miR-216a/miR-18 1b在衰老的内皮细胞中表达上调,但其作用机制仍不清楚。研究方法1.原代培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),建立HUVECs衰老模型。实时荧光定量PCR在PDL8及PDL44内皮细胞中检测miR-216a/miR-181b,比较其表达水平。2.通过病毒感染建立稳定高表达miR-216a的内皮细胞系,检测衰老相关的β半乳糖苷酶(Senescence Associated β-Galactosidase, SA-β-gal)活性、细胞周期蛋白表达水平、端粒长度及端粒酶活性,鉴定其是否出现衰老表型。3.分别用MTS法、Scraching实验、成管实验及粘附实验检测过表达miR-216a/miR-181b的内皮细胞增殖、迁移、成管和粘附功能的改变。4.通过生物信息学方法预测与miR-216a/miR-181b存在结合位点的靶基因,在内皮细胞中过表达miR-216a/miR-181b,用western blot检测靶基因的表达变化。荧光素酶报告系统实验检测miR-216a/miR-181b与靶基因是否直接结合。研究结果(一)MiR-216a对血管内皮细胞衰老和内皮细胞功能的影响1.与PDL8 HUVECs相比,PDL44 HVUECs的SA-β-gal蓝染细胞比例增加4.7倍(P<0.001),p53及p21表达分别上调69%(P=0.003)和61%(P=0.01),端粒长度缩短42%(P=0.01),呈现明显衰老状态。在PDL44 HUVECs中, miR-216a表达上调59%(P=0.028)。2.与对照组相比,过表达niR-216a的内皮细胞传代到PDL20时出现明显的形态学变化及生长抑制。在PDL20 HUVECs的SA-P-gal蓝染细胞比率增加61%(P=0.001),p53和p21的表达水平显著上调,端粒酶活性下降13%(P=0.031)；但端粒长度未发现明显改变。3.MiR-216a可使PDL20 HUVECs增殖功能下降15%(P<0.001),迁移能力下降16%(P<0.001),内皮细胞对单核细胞的粘附能力上调95%(P=0.002)：反之,给予PDL44 HUVECs miR-216a的抑制剂,内皮细胞增殖能力上调12%(P=0.027),迁移能力增加11%(P=0.012),粘附能力下降16%(P=0.01)。4.生物信息学预测发现SMAD7可能是miR-216a的靶基因,在内皮细胞中过表达miR-216a可抑制SMAD7表达50%(P=0.02),且荧光素酶报告系统实验检测到miR-216a可与SMAD7 3’-UTR区的直接结合,使荧光素酶活性下降91%(P<0.001)。(二)MiR-181b对血管内皮细胞衰老和内皮细胞功能的影响1.在PDL44 HUVECs中,miR-181b表达上调64%(P=-0.046)。2.与对照组相比,过表达miR-181b可抑制PDL8内皮细胞的增殖能力22%(P<0.001)、迁移能力23%(P<0.001),对成管能力没有显著影响。3.在PDL44 HUVECs中,IGF1R的mRNA和蛋白水平分别下调39%和45%(P=0.004,P=0.014)。荧光素酶活性实验显示miR-181b可与IGFlR的3’UTR结合,但过表达miR-181b对IGF1R的蛋白表达水平无显著影响(P>0.05)。在缺氧应激条件下,miR-181b可上调IGF1R的表达27%(P=0.005)。结论本研究结果表明miR-216a可诱导内皮细胞出现早衰表型,并起到促进内皮细胞粘附能力,抑制内皮细胞增殖、迁移能力的作用,其可能的分子机制是通过抑制SMAD7的表达来发挥其调节功能。MiR-181b抑制血管内皮细胞增殖、迁移等血管新生能力,这一作用与miR-181b在缺氧应激条件下上调血管发育相关基因IGF1R的表达相关,其机制仍需进一步研究。